Концентрация геля агарозы

Чувствительность метода обнаружения нуклеиновых кислот в гелях с помощью бромистого этидия очень высока в гелях агарозы легко удается наблюдать полосы, содержащие 0,01 мкг ДНК, а в ПААГ — доли микрограмма. Рабочая концентрация водного раствора красителя при окрашивании нуклеиновых кислот в гелях составляет около 1 мкг/мл. В таком растворе гель вымачивают в течение 0,5—1 ч или же вводят бромистый этидий в рабочий буфер геля при его полимеризации. [c.150]

Показано, что при высокой концентрации гуанидин-НС1 восстановленные белки приобретают конформацию статистического клубка. В качестве эмпирического метода определения молекулярных масс денатурированных белков рекомендуется использовать хроматографию в 6 М гуанидин-НС1 на гелях агарозы. [c.32]

В настоящее время почти исключительно используются полиакриламидные гели (ПААГ) и гели агарозы. Варьируя концентрацию полимера, можно получать гели с очень широким диапазоном размеров пор. Кроме того, можно изменять электрические заряды макромолекул путем вариации pH буфера, а их конфигурацию путем введения в буфер денатурирующих агентов или детергентов. Все это придает методу электрофореза исключительную гибкость. [c.4]

Выбор концентрации агарозы, т. е. пористости ее геля, диктуется размерами фракционируемых макромолекул. Средний размер пор 2%-ного геля агарозы приблизительно соответствует диаметру сферически упакованной молекулы биополимера с массой 50 млн. дальтон. Гели с более высоким содержанием агарозы используют для гель-фильтрации. При электрофорезе поры геля должны быть легко проницаемы для молекул биополимеров, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом [c.19]

Ранее было показано, что электрофоретическая подвижность биополимеров в геле (и ) пропорциональна их подвижности в свободной жидкости ( о), которая определяется отношением суммарного заряда макромолекулы к ее массе. Фактором, обусловливающим отличие и от щ, является сила трения о гель, которая зависит от соотношения линейных размеров макромолекул и пор геля, а следовательно, от молекулярных масс белков и концентрации ПААГ. Молекулярные массы подавляющего большинства индивидуальных белков не превышают 500 ООО. Поэтому использование гелей агарозы оказывается нецелесообразным, кроме тех случаев, когда разделение белков хотят вести только по величине отношения заряда к массе. Как правило, электрофорез белков проводят в ПААГ, содержащем 5—20% акриламида. [c.37]

Вторая особенность электрофореза нуклеиновых кислот и их фрагментов — очень широкий диапазон молекулярных масс. Например, при определении нуклеотидной последовательности ДНК или РНК приходится разделять полученные при их гидролизе олигонуклеотиды, содержащие единицы и десятки мономерных звеньев, т. е. молекулы с массами от тысячи до нескольких сотен тысяч дальтон, а это — тот же диапазон, что для белков и пептидов. Естественно, что электрофорез при этом ведут в ПААГ с концентрацией от 5 до 20%, в зависимости от конкретной задачи. С другой стороны, электрофорез можно успешно использовать для разделения плазмид, крупных рестриктов ДНК и даже целых молекул ДНК или РНК вирусов. В этих случаях электрофорез ведут в гелях агарозы. [c.121]

Исследование показало, что в 0,1%-ном геле агарозы расстояние миграции полос связано с логарифмом молекулярной массы ДНК линейной зависимостью в интервале от 6 до 110 млн. дальтон. Для получения хорошего разделения полос электрофорез в гелях низкой концентрации следует вести при малых значениях напряженности электрического поля. Например, для указанного выше варианта разделения ДНК в 0,1%-ном геле агарозы автор рекомендует ограничиться напряженностью поля 0,34 В/см. Длительность электрофореза при этом составляет 20 ч. [c.122]

Направление У — электрофорез в 1%-ном геле агарозы направление 2 — электрофорез в 4%-ном ПААГ, полимеризованном в градиенте концентрации денатурирующих добавок (0—7 М мочевины и О—40% формамида) [c.136]

Полиакриламидные гели низкой концентрации, применяемые при изучении, например, нуклеиновых кислот или нуклеопротеидных частиц, обладают низкой механической прочностью. Для ее повышения предложено вводить в гель агарозу [984, 1324]. Способы приготовления составных и полиакриламидных гелей практически не отличаются друг от друга. Очищенную агарозу растворяют в воде при нагревании в колбе с обратным холодильником. Полученный раствор, в котором концентрация агарозы должна быть в два раза выше, чем ее конечная концент- [c.101]

Б. В Иммуноэлектродиффузия или ракетный иммуноэлектрофорез [66], Гель агарозы содержит равномерно распределенную иммунную сыворотку. В лунки внесены антигенные растворы разных концентрации. Электрофоре. проводится при pH, при котооом антитела не мигрируют либо мигрируют очень мало. Антигены под действием электрического поля мигрируют в геле, содержащем антитела. Комплексы при избытке антигенов вначале растворимы, продолжают мигрировать в ходе электрофореза, а также посредством диффузии, обогащаются антителами, н, когда соотношение антигенов и антител достигает точки эквивалентности, они осаждаются в форме ииков. [c.102]

Биогель А (фирма Bio-Rad). Носители сферической формы на основе гелей агарозы, содержащие очень мало заряженных групп. Интервал фракционирования определяется концентрацией агарозы в гранулах. Совместим со всеми обычными буферными растворами. Гели, содержащие >2% агарозы, устойчивы к 6 М гуанидингидрохлориду и 7 М мочевине, хотя и может произойти небольшая усадка гели с содержанием агарозы < 2% под действием указанных агентов претерпевают структурную деградацию. Гель устойчив при pH 4 10 устойчив к действию 0,1 М NaOH или 1 М НС1 в течение 2-3 ч может разрушаться под действием окислителей. Интервал рабочих температур 2-30°С размягчается при температуре > 40°С. Замораживание вызывает разрушение гелевой структуры. Поставляют в набухшем состоянии. [c.442]

Сефароза (фирма Pharma ia). Носители на основе гелей агарозы, содержащие очень мало заряженных групп. Интервал фракционирования определяется концентрацией агарозы в гранулах. Устойчив в водных растворах при pH 4 — 9. Может быть использован в растворах, содержащих высокие концентрации солей, мочевины, гуанидингидрохлорида, хотя в условиях, способствующих сильной диссоциации, предпочтительнее использовать сефарозу L. Разрушается под действием окислителей. Плавится при нагревании не следует использовать при температуре > 40°С. Можно стерилизовать химическим способом, например путем обработки диэтилпиро-карбонатом, но не путем автоклавирования. Не замораживать замораживание разрушает структуру зерен. [c.442]

На стеклянную пластинку обычным способом наносят 1 %-ный гель агарозы, содержащий 2,5%-ную иммунную сыворотку анти-IgG. В затвердевшем геле агарозы вырезают нужное число круглых лунок для исследуемой сыворотки и IgG и заливают в них по несколько капель агарозного раствора. Препараты IgG известной концентрации в соответствующем разведении вносят в несколько лунок в остальные лунки заливают образцы исследуемых сывороток и проводят электрофорез, как описано выше. В зависимости от соотношения концентрации антигена и антител продолжительность электрофореза может варьировать от 2 до 10 ч. Электрофорезг следует закончить, когда прекратится увеличение преципитационных пиков, т. е. когда избыток антигена будет нивелирован электро- [c.156]

В работах Аицавы и сотр. [1, 2], посвященных исследованию гелей агарозы методами ЯМР высокого разрешения и широких линий, было показано, что вода в гелях этого типа находится в трех состояниях. На кривых зависимости ширины линий протонов воды от содержания воды в геле имеется две точки излома, одна из которых обусловлена существованием связанной воды. Имеется три типа температурных переходов при температуре ниже О °С, Для свободной воды характерен переход при О °С, интервал перехода растягивается до —20 °С, В этом интервале перехода для связанной воды не наблюдается [1], Аутред и Джордж [132] описали метод для определения параметров, характеризующих подвижность протонов в гидратированных системах, в том числе в гидратированных агарозе и желатине. Экспериментальные данные для агарозы согласуются с теоретическими представлениями о том, что часть протонов распределена по центрам, на которых вода имеет пониженную подвижность эта вода быстро обменивается с нормальными молекулами воды. Состояние протонов воды, адсорбированных на поверхности желатины, является промежуточным между состояниями, характерными для протонов жидкой воды и льда. (Количество связанной воды зависит от концентрации желатины.) Эти протоны являются, вероятно, протонами желатины, участвующими в спин-решеточной релаксации с протонами из жидкой фазы посредством обмена и спиновой диффузии. [c.489]

Из рис. 5.3, б видно, что количество связанного трипсина, определенное экспериментально в ходе исследования равновесного связывания, зависит от концентрации исходного раствора трипсина (в 0,05 М бицине, pH 8,15, и 0,25 М хлориде калия, 4 ч, 4°С), а также что только аффинный сорбент, приготовленный из 4%-ного геля агарозы, содержащего 19,2 мкэкв./мл ж-аминобензамиднна, характеризуется идеальным поведением. Этот носитель имеет существенно более высокую емкость при насыщении, чем аффинный сорбент, приготовленный из 6%-ной агарозы, содержащей [c.66]

Борковский и др. [94] разделяли основания ДНК, аденин, гуанин, цитидин и тимин методом электрофореза на слоях агарового геля, используя 0,1 М буферный раствор ацетата натрия и уксусной кислоты (pH 3,7). Электрофорез, проводили в течение 45 мин при напряженности поля 5—7 В/см. Образец получали в результате 60-минутного гидролиза ДНК 72 %-ной хлорной кислотой, а после гидролиза выпаривали хлорную кислоту, освобождая основные соли. Цанев и др. [95] изучали влияние концентрации РНК, величины pH, температуры, состава буферного раствора и концентрации геля на фракционирование и подвижность РНК при электрофорезе на слоях геля. Для электрофоретического разделения АМР, ADP, АТР [96] и смесей аденина, аденозина, адениловой кислоты и ди- и трифосфатаденозинов [97] применяли также гель агарозы. [c.136]

Заливать пластину удобно открытым способом, нанося дозированный объем раствора агарозы с амфолитами из подогретой пипетки на пластмассовую подложку, установленную строго горизонтально с помощью регулируемого по уровню столика. Во избежание быстрого и неравномерного застывания агарозы между подложкой и столиком целесообразно положить теплоизолирующую прокладку. Пластина агарозы после полимеризации легко снимается с подложки. При концентрации агарозы 0,8—1% она достаточно прочна, чтобы быть в свободном состоянии перенесенной на охлаждающую плиту прибора для горизонтального элект4)офореза (рис. 13). Впрочем, фирма Pharma ia предлагает и другой вариант. Она поставляет специальные пластмассовые подложки Gel Bond , на которых путем особой обработки прочно закреплен тонкий слой агарозы. После заливки, которую фирма рекомендует осуществлять с помощью ограничительной рамки, гель агарозы прочно пристает к подложке и далее всю обработку, включая высушивание, проводят на ней. Как и при электрофорезе, пластины агарозы перед использованием для завершения полимеризации следует выдерживать на холоду во влажной камере в течение суток. [c.43]

Носителями в данном случае чаще всего служат ацетат целлюлозы [26] и гели агарозы [4]. Разрешающая способность таких систем очень низка из-за чрезмерного диффузионного размывания зон. Применение в качестве носителя крахмального или полиакриламидного геля значительно повышает разрешающую способность прежде всего благодаря молекулярно-ситовому эффекту. Иммуноэлектрофорез [56] является одной из разновидностей зонного электрофореза при постоянном значении pH после разделения белки диффундируют навстречу специфическим антителам и их взаимодействие приводит к образованию дуг иммунопреципитации. Полуколичественную оценку каждого антигенного компонента можно выполнить методом электроиммунодиффузии [57]. После разделения методом зонного электрофореза антигенные белки электрофоретически мигрируют в направлении, перпендикулярном прежнему пути, в гель, содержащий равномерно распределенные антитела. Высота образующихся пиков преципитации является мерой относительной концентрации белков в смеси. [c.120]

Разливают раствор во флаконы с крышками по 20—40 мл и хранят при 4°С. Для иммунодиффузии и некоторых модификаций ИЭФ вместо агарозы можно использовать агар (см. разд. 4.1.4, п. 2). Для этого -готовят 1,0—1,5%-ный (вес на объем) раствор агара в PBS или 0,85%-ном растворе Na l с 3% ПЭГ. Однако удобнее приготовить стандартный агарозный гель, -который можно использовать при осуществлении любого метода. Агароза хорошо растворима, легкоплавка, не застывает при 56 °С, а при охлаждении быстро превращается в прозрачный гель, обладающий при концентрации 1 % достаточной прочностью. Подвижность крупных молекул зависит от концентрации геля. [c.201]

Уже упоминалось, что эффект эндосмоса снижается при увеличении вязкости пронизывающей гель жидкости. В гелях агарозы для этой цели обычно используют сорбит в концентрации 10— 2%. Его растворяют в воде, затем насыпают на поверхность раствора сухую агарозу, дают ей набухнуть и осесть и, как обычно, нагревают раствор на кипящей водяной бане до тех пор, пока не прекратится выделение пузырей воздуха, что свидетельствует о полном растворении агарозы. Колба с раствором при этом должна быть хорошо закрыта. Амфолиты виосят перед заливкой, после охлаждения раствора до 60—70°. [c.43]

На строго горизонтальную поверхность пластины ПААГ быстро выливают расплавленный 0,5%-ный раствор агарозы в СФБ, чтобы получить слой толщиной 1 мм. Предварительно агарозу смешивают при 56° с разбавленной специфической антисывороткой. После застывания геля агарозы такую двуслойную пластину выдерживают при 37° во влажной камере 2—6 ч, в зависимости от размера молекул антигена, диффундирующих из ПААГ в агарозу. Затем, отметив на пленке агарозы положение лидирующего красителя в рабочем ПААГ, ее снимают, покачивая пластинку в СФБ. Пленка агарозного геля легко отделяется от ПААГ. Одновременно с диффузией в гель агарозы идет им-мунохимическая реакция антигенов с находящимися в геле антителами и образование преципитатов. Пленку вымачивают в течение 4 ч в том же буфере, удаляя из нее не прореагировавшие иммуноглобулины антисыворотки и белки неантигенной природы, перешедшие туда из ПААГ. Преципитировавшие иммунные комплексы с участием искомого антигена можно окрасить обычными способами или обнаружить методом авторадиографии, если антиген или антитела несут радиоактивную метку. Отметим, что преципитация здесь требует подбора концентраций и довольно значительного времени диффузии антигенов в агарозу для обеспечения эквивалентного соотношения концентраций антител и антигена. [c.129]

Это — количественный метод определения концентрации антигена [Laurell, 1966]. Раствор белка-антигена заливают в лунку, вырезанную на краю пластины геля агарозы с введенной в него антисывороткой. Под действием электрического поля белок мигрирует в этом геле. В ходе миграции образуются иммунные комплексы, связывающие антиген. Миграция продолжается до полного исчерпания антигена — по расстоянию миграции можно судить о его количестве. Это расстояние доступно наблюдению [c.139]

Стеклянную пластину заливают расплавленным 1%-ным раствором агарозы в 0,075 М Na-барбитуратном буфере (pH 8,6), содержащем 0,2—0,6 мМ лактата кальция и 0,02% азида натрия, так чтобы получить слой геля толщиной 1 мм. Перед заливкой при 48—50° в раствор агарозы вносят антисыворотку до концентрации 0,5—10% по объему или соответственно меньшее количество очищенных антител и хорошо перемешивают. О подборе концентраций антисыворотки (и антигена) будет сказано ниже. Гель должен надежно пристать к стеклу, иначе антиген при электрофорезе будет мигрировать в слое свободной жидкости по зазору между стеклом и гелем. Ввиду этого имеет смысл предварительно нанести на подогретое стекло тонкий слой 1 % -ного водного раствора агарозы, дать ему затвердеть, а потом высушить при 70°. Фирма LKB предлагает пластины из специально обработанного пластика, с которым гель агарозы связывается прочнее, чем со стеклом. [c.140]

Концентрации исследуемых растворов антигена, как и исходное разбавление и" объемную концентрацию антисыворотки в геле агарозы, приходится подбирать опытным путем, чтобы ракеты были достаточно хорошо видны, а их высоты (после исчерпания запасов антигена во всех лунках) лежали в интервале 1—5 см. Такие высоты можно достаточно точно измерить вместе с тем, электрофорез не занимает слишком много времени. Очевидно, что чем больше отношение концентрации антигенов в лунках к концентрации антител в геле, тем выше будут ракеты Лорелла . Абсолютные же значения этих концентраций диктуются необходимостью получения четких линий преципитации. В качестве ориентировочных цифр можно рекомендовать загрузку 5 мкг антигена на лунку при внесении в гель неразбавленной антисыворотки до концентрации 2,5% по объему. Если гель предполагается окрашивать, то обе исходные цифры можно уменьшить в 10 раз. Опыты можно ставить в двух вариантах с полиспецифической антисывороткой для определения количества чистого антигена или с моноспецифической для определения количества данного антигена в смеси с другими. [c.142]

Назначение ДОХ-Na — способствовать выходу белков из ПААГ в агарозу. При pH 8,6 ДОХ-Na заряжен отрицательно и мигрирует через полоску ПААГ в направлении анода. Образованию иммунного комплекса он не мешает. В гель агарозы с антителами был введен еще и полнэтиленгликоль в концентрации 4%. Замечено, что он способствует иммунопреципитации и в несколько раз увеличивает чувствительность метода. [c.150]

Выше был описан тандемный способ идентификации одного из антигенов в их смеси при перекрестном иммуноэлектрофорезе. Для него требуется наличие чистого антигена. В том случае, когда вместо этого в распоряжении исследователя имеется моноспецифическая антисыворотка для этого антигена, с той же целью можно воспользоваться другим приемом — введением промежуточного геля. Вслед за окончанием электрофореза в первом направлении готовят пластину для второго направления, как было описано в случае обычного перекрестного иммуноэлектрофореза. Затем из слоя геля агарозы с полиспецифической антисывороткой вырезают и удаляют полосу шириной 1 — 2 см, прилегающую к гелю первого направления. На ее место заливают новую порцию раствора агарозы той же концентрации, но смешанного с моноспецифической антисывороткой. [c.151]

Сочетание прочности и крупнопористости делает гели агарозы незаменимыми при электрофорезе особенно крупных макромолекул, в частности нуклеиновых кислот. Агароза—это особо чистая фракция природного линейного полисахарида агара, который извлекают из некоторых видов морских водорослей. В полимерной цепи агарозы чередуются р-/)-галактопираноза и 3,6-ангидро-а-1-галактопираноза. Молекулярная масса ее составляет 10 —10. Гелеобразование идет, как уже указывалось, путем связывания в пространственную сетку пучков нитей за счет водородных связей между ними. Некоторые виды агарозы обра зуют прочные гели уже при концентрации 0,3%. [c.16]

Для фракционирования по размерам очень высокомолекулярных ДНК с молекулярной массой до ПО млн. Север использовал гели агарозы малой концентрации (вплоть до 0,1%). Такие гели являются полужидкими по своей консистенции и могут быть использованы только в варианте горизонтального электрофореза. На стеклянной пластине сначала заливают рамку из 1,5%-ной агарозы, которую затем заполняют агарозой малой концентрации [Sewer, 1980]. В то время как скорость миграции двунитевой линейной ДНК в свободной жидкости не зависит от ее-молекулярной массы (ввиду постоянства отношения заряда к линейному размеру), электрофорез в гелях агарозы малой концентрации обнаруживает эффект значительного трения ДНК о гель. Даже для ДНК с Л1 = 2 млн. скорость миграции увеличивается в 1,5 раза при переходе от 0,57о-ной агарозы к 0,1%-ной, а для ДНК с М=25 млн. это увеличение оказывается шестикратным, причем в 0,1%-ной агарозе такая ДНК мигрирует еще вдвое медленнее, чем в свободной жидкости. [c.122]

Аналогичное, хотя и менее детальное, исследование возможностей фракционирования высокомолекулярных ДНК в гелях агарозы малой концентрации было проведено ранее [Fangman, [c.122]

Микель и соавторы имели в своем распоряжении более 10 исходных сверхскрученных пл азмидных ДНК с молекулярными масса ми от 3,6 до 55 млн. Облучением в присутствии бромистого этидия из них были получены расправленные кольцевые молекулы с разрывом в одной нити, а с помощью рестриктазы Есо RI — линейные двунитевые молекулы той же молекулярной массы, что и исходные плазмиды [Mi kel et al., 1977]. Авторы сопоставляли электрофоретические подвижности всех этих молекул в гелях агарозы различной концентрации. Было обнаружено, что ДНК в виде расправленного кольца (форма II) не только мигрирует медленнее двух остальных форм, но, начиная с молекулярной массы 14—16 млн., вообще не входит даже в 0,6%-ный гель агарозы (рис. 31). [c.124]

Для решения такой же задачи другие авто-эы использовали 1%-ный [Barnes, 1977] и, 2%-ный гели агарозы [Fantoni et al., 1979]. Очевидно, что концентрацию агарозы можно варьировать в зависимости от ожидаемого размера плазмид. Выбор буфера, как уже указывалось, не играет больщой роли. [c.126]

Уже отмечалось, что вместо буфера в ПААГ и гелях агарозы можно использовать разбавленные водные растворы щелочи (0,02—0,03 М NaOH). Полимеризация акриламида в щелочной среде идет вполне успешно, но требует примерно трехкратного увеличения концентрации персульфата аммония и соответственно ТЕМЕД. На застывании раствора агарозы присутствие щелочи не сказывается. В щелочной среде благодаря электростатическому отталкиванию остатков фосфорной кислоты однонитевые ДНК и РНК не свертываются в клубки, а мигрируют в виде расправленных нитей. Жесткость таких нитей тем больше, чем они короче, подобно тому как это имеет место и для двунитевых молекул. При этом и скорость миграции однонитевых молекул оказывается приблизительно такой же, как у двунитевых, нативных молекул той же длины. [c.129]

Был провёден матричный синтез РНК с помощью РНК-полимеразы Е. соИ. Один из рибонуклеозидтрифосфатов был радиоактивно меченным по фосфору. В качестве матриц использовали рестрикты ДНК (или ДНК разрезали рестриктазами после окончания синтеза РНК). Процесс транскрипции ограничивали по времени и концентрации трифосфатов таким образом чтобы новосинтезироваиная меченая РНК содержала не более 100— 200 нуклеотидов. Тройной комплекс транскрипции подвергали электрофорезу в пластине 1,2%-ного геля агарозы размером [c.147]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология