Рестрикция ДНК и ферменты модификации

Для выделения генов, кодирующих ферменты рестрикции и модификации (метилирования), можно использовать также другой подход, который состоит в следующем. [c.248]

Ключевым моментом этого метода является то, что плазмидная ДНК клонов, несущих и экспрессирующих ген фермента модификации, оказывается устойчивой к расщеплению соответствующей эндонуклеазой рестрикции, поскольку сайты узнавания в ней метилированы. [c.248]

Фермент рестрикции и модификации [c.434]

Рестрикция ДНК и ферменты модификации [c.266]

Прогулка по хромосоме Рекомбинантная ДНК Уравнение Со1 Фермент модификации ДНК Фермент рестрикции ДНК Электрофорез в геле [c.291]

Механизмом, предотвращающим смешивание генетического материала прокариот разных видов, служат процессы рестрикции и модификации ДНК, осуществляемые соответствующими ферментами. Рестрикционные эндонуклеазы (рестриктазы) расщепляют проникшую в клетку чужеродную ДНК. Они распознают специфические нуклеотидные последовательности и разрезают по ним или рядом с ними двухцепочечные молекулы ДНК. Модифицирующие метилазы клетки обеспечивают метилирование оснований своей ДНК в участках, чувствительных к рестриктазам. Модифицированные таким путем участки становятся устойчивыми к действию рестриктаз. (В противном случае молекула ДНК расщеплялась бы собственными рестриктазами.) Таким образом, процессы модификации и рестрикции обеспечивают защиту собственной ДНК от проникшего в клетку чужеродного генетического материала. [c.133]

В дальнейшем выяснилось, что один и тот же штамм может осуществлять несколько типов рестрикции и модификации. Из клеток, способных к рестрикции, были выделены эндонуклеазы, специфичные к определенным нуклеотидным последовательностям неадекватно модифицированной ДНК. Эти ферменты широко применяются в работах по генной инженерии (см. гл. 11). [c.222]

Ферменты модификации защищают ДНК хозяина от действия эндонуклеаз рестрикции. При этом одна и та же молекула может [c.222]

Ферменты рестрикции и модификации нуклеиновых кислот [c.48]

Механизм инактивации и избирательного разрушения хромосом остается неизвестным предполагается, что в своей химической основе он имеет сходство с процессами модификации и рестрикции, свойственными бактериям (гл. 15, разд. Е) [182]. С помощью системы метилирования одна хромосома может быть помечена и сохранена, тогда как другая — подвергнуться последовательным воздействиям отстригающей эндонуклеазы. С другой стороны, не исключено, что какой-то другой фермент инициирует переход хромосом в гетерохроматин. [c.363]

Ферменты рестрикции-модификации [c.891]

При метилировании бактериальной ДНК в соответствующих сайтах она становится иммунной к рестрикта-зам (рис. 34.1). Такая защита необходима для предотвращения деградации ДНК клетки под действием ее собственных рестриктаз. Однако этот способ защиты не распространяется на любую чужеродную ДНК, входящую в клетку. Она имеет немодифицированные сайты-мишени и поэтому атакуется ферментом рестрикции. Следовательно, комбинация модификации и рестрикции позволяет клетке отличать чужеродную ДНК от своей собственной. [c.432]

Рис. 34.2. Полифункциональные ферменты типа I содержат различные субъединицы для рестрикции, модификации и узнавания.

К 1970 г. исследования так называемой системы рестрикции и модификации, которая существует в прокариотических клеткак и предохраняет от попадания внутрь клетки чужеродной генетической информации, приаели к выделению первого из ферментов, осуществляющих рестрикцию. Им оказалась эндонуклеаза, расщепляющая ДНК по определенной последовательности оснований. Затем было найдено около 400 подобных ферментов, способных узнавать свыше 90 различных последовательностей в ДНК. [c.297]

В настоящее время рестриктазы подразделяют на три класса с )гчетом RMS-системы, в которой RMS — белки рестрикции, метилирования (модификации) и посадки соответственно К первому из них относят те рестриктазы, которые расщепляют ДНК в произвольных точках с образованием различных фрагментов ДНК (для обеих нитей ДНК известны системы R2M2S), ко второму классу (их известно около 500) относят ферменты, для которых сайты рестрикции и посадки совпадают — RS и MS Образующиеся при этом фрагменты (рестрикты) воспроизводятся по длине Рестриктазы этого класса, объединяющие рестриктазы вышеуказанных трех групп, преимущественно использзшэтся на практике Рестриктазы III класса (например из фага Р1, системы 2R MS) объединяют все прочие рестрикционные эндонуклеазы Отдельные из них, например, не узнают сайтов посадки Их редко используют на практике [c.189]

Бактерия способна отличить свою собственную ДНК от любой вторгающейся чужеродной именно по типу ее модификации. Различие в модификации делает чужеродную ДНК чувствительной к действию рестрици-рующих ферментов, которые узнают отсутствие метильных групп в соответствующих сайтах. Системы рестрикции и модификации широко распространены у бактерий их сушествование играет важную роль в защите резидентной ДНК от загрязнения последовательностями чужеродного происхождения. Следует отметить, однако, что присутствие системы модификации и рестрикции не обязательно некоторые бактериальные штаммы утратили ее. [c.431]

Ко второму классу активностей, характеризующих систему рестрикции и модификации отнесены активности ферментов типа I и III. Эти ферменты представляют собой мультимеры и выполняют в клетке как эндонуклео-тическую, так и метилирующую функции. Механизмы их действия отличны друг от друга и от механизма действия ферментов типа II. Точно не известно, у какой части бактерий функционируют системы типа I или III, однако очевидно, что они менее распространены, чем система типа II. [c.433]

I, состоящих из трех разных субъединиц. Субъединица R ответственна за рестрикцию, субъединица М-за метилирование, а субъединица S-за узнавание сайта-мишени ДНК. После того как сайт-мишень узнается S-субъединицей, происходит связывание фермента с ДНК, а затем либо ее рестрикция, либо модификация активности субъединиц R и М являются взаимоисключаюндими. [c.433]

Практически все виды бактерий синтезируют но одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндонуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктаза-ми), поскольку их основная функция состоит, но-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов. [c.266]

При изучении очищенных эндонуклеаз рестрикции, или рест-риктаз, Е. ali К и бактериофага Р1 выяснилось, что они переносят метильные группы с S-аденозилметионина на немодифициро-ванную ДНК, после чего она становится устойчивой к рестрикции. Таким образом, по крайней мере в некоторых случаях, функции рестрикции и модификации совмещены в одном ферменте. [c.223]

Рестриктазы О явлении рестрикции и модификации у бактерии уже упоминалось в гл 5. В частности подчеркивалось, что специальные ферменты — рестриктазы — узнают в ДНК определенные специфические для каждого фермента последовательности нуклеотидов и расщепляют ее, e jin она не модифицирована в этих же участках сайт-специфическими метилазами. Уже описано около 2500 рестриктаз, выделенных из разных микроорганизмов. [c.163]

Открытие рестриктаз уходит корнями в исследование молекулярных основ феномена хозяйской специфичности, обнаруженного в начале пятидесятых годов, в ходе изучения эффективности посева фагов при смене хозяина [76, 234, 235]. Последующие исследования этого явления, выполненные в основном Арбером с сотр. [60, 61, 62, 126, 232], привели к раскрытию состава и особенностей функционирования штаммоспецифической системы рестрикции и модификации ДНК. В эту систему входят два специфичных для определенного штамма фермента — ДНК модифицирующий (метилаза цитозиновых или адениновых остатков ДНК) и ДНК расщепляющий (эндодезок-сирибонуклеаза-рестриктаза). Эти ферменты узнают в ДНК идентичные короткие последовательности нуклеотидов. Метилаза, модифицируя определенные основания в пределах узнаваемого участка, защищает внутриклеточную ДНК от действия рестриктазы. Проникшая в микробную клетку, обладающую системой хозяйской специфичности, немодифицированная соответствующим образом ДНК подвергается расщеплению внутриклеточной специфической эндонуклеазой. В подавляющем большинстве случаев это приводит к инактивации этой ДНК. [c.6]

Гипотеза оказалась плодотворной, и открытие ферментов рестрикции — эндодезоксирибонуклеаз, или рестриктаз, — и ферментов модификации — ДНК-метилтрасфераз, часто называемых ДНК-меттазами, — полностью ее подтвердило. [c.14]

Системы рестрикции II типа обнаружены у очень многих бактерий. Эти системы состоят из двух отдельных ферментов, рестриктазы н метилазы, узнающих одну и ту же последовательность ДНК — сайт рестрикции. Если сайт рестрикции не метилирован, то рестриктаза вносит в него двуцепочечный разрыв. ДНК не подвергается рестрикции, если хотя бы одна цепь метилирована. Такие свойства предохраняют собственную ДНК бактерий от рестрикции собственная ДНК либо полностью метилирована по всем сайтам рестрикции, либо, после репликации, патуметилирована. На полуметилированные сайты рестрикции действует метилаза и метилирует их полностью. Как и прочие клеточные метилазы, метилазы системы рестрикции-модификации в качестве донора метильных групп нс-патьзуют 5-аденозилметионин. В табл. 7 для примера приведены данные о некоторых рестриктазах и метилазах II типа. [c.130]

Т 2, Т4 и Тб) вместо цитозина входит оксиметилцитозин, большин-ст во остатков которого к тому же еще глюкозилированы. ДНК, мо-ди фицированную подобным образом, не разрезают почти все известные рестриктазы. Такой способ борьбы с рестрикцией могут позволить себе лишь крупные фаги, поскольку для этого фаг должен кодировать фактически новый метаболический путь синтеза необычных нуклеотидов, а также новые ферменты синтеза ДНК, адаптированные к необычным свойствам фаговой матрицы и к использованию необычного субстрата. Зато столь радикальная модификация ДН К позволяет фагам, использующим эту тактику, не только защищаться от хозяйских рестриктаз, но и пойти дальше они коди-р уют нуклеазы, деградирующие немодифицированную ДНК хозяина, но не действующие на фаговую ДНК. Другие фаги используют еще ряд способов борьбы с системой рестрикции хозяина. [c.133]

Сенжер и Коулсон создали метод анализа последовательности ДНК, который основан на ферментативном копировании однонитевых частиц ДНК [18]. Максам и Гилберт создали метод, в основу которого положена химическая модификация четырех оснований, входящих в состав ДНК, и который с одинаковым успехом применим как к однонитевым, так и к двунитевым молекулам ДНК [19]. Оба метода используют авторадиографическое определение згр-меченных олигонуклеотидов, которые разделяют в зависимости от их длины электрофорезом денатурированных фрагментов в полиакриламидном геле. На практике, успех этих методов во многом определяется недавними достижениями в энзимологии нуклеиновых кислот, особенно использованием ферментов рестрикции, расщепляющих молекулы ДНК, и обратной транскриптазы, с помощью которой получают циклические ДНК, комплиментарные РНК-матрице. Нижеследующее описание методики анализа будет, однако, предполагать наличие гомогенных образцов ДНК подходящей длины. [c.188]

Эти ферменты являются компонентами системы рестрикции — модификации прокариотических клеток, которая предназначена для их защиты от чужеродных ДНК. К рестрикционным эндонуклеазам относятся также и все другие ферменты, специфически расщепляющие ДНК по определенной последовательности, хотя часто их роль в процессах рестрикции — модификации не доказана. В зависимости от характера узнаваемой нуклеотидной последовательности ( сайта ), мест расщепления и условий реакции ре-стриктазы делятся на три класса. [c.309]

Для нормального функционирования аппарата исправления ошибок, связанных с включением неправильных нуклеотидов, необходимо располагать механизмом, позволяющим отличать новосинтезированную цепь ДНК от родительской матричной цепи. В противном случае с вероятностью 1/2 будет происходить исправление нуклеотида в родительской цепи, приводящее к закреплению потенциально мутагенной ошибки, допущенной ДНК-полимеразой. Вероятно, для установления различий между родительской и дочерней цепями ДНК в Е. соИ используется метилирование аденина в последовательности GAT . Эта палиндром-ная последовательность обычно метилирована в обеих цепях родительской ДНК. При полуконсервативной репликации метилированной ДНК образуется дочерняя ДНК, в которой одна цепь, пришедшая от родительской ДНК, метилирована, а новообразованная цепь в течение некоторого времени после выхода из области репликативной вилки остается неметилированной. Следует заметить, что метилирование новообразованной цепи ДНК осуществляется ферментом, отличным от метилаз, входящих в систему рестрикции—модификации, обсуждавшуюся в гл. 9. Бактерии dam , дефектные по метилированию аденина в результате нарушения синтеза соответствующей метилазы характеризуются повышенной частотой спонтанных мутаций, что подтверждает гипотезу об участии метилазы dam в системе исправления ошибок репликации. [c.123]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология