Разделение нуклеиновых кислот и рестриктаз

С учетом вышеуказанного в качестве основных этапов выделения рестриктаз будут рассмотрены следующие получение бесклеточных экстрактов, разделение нуклеиновых кислот и целевых ферментов и хроматографическая очистка последних. [c.143]

Разделение нуклеиновых кислот и рестриктаз [c.144]

Эффективным, давно известным способом разделения нуклеиновых кислот и белков, является использование двухфазных водных систем [2]. Однако, примеры использования таких систем в работах, посвященных решению этой проблемы в случае выделения рестриктаз, немногочисленны [119, 179, 202, 298]. Предположительно это связано с необходимостью подбора условий проведения экспериментов, обеспечивающих избирательное распределение компонентов разделяемой смеси между фазами и некоторыми сложностями при переходе на последующую стадию очистки. [c.147]

Хроматографические методы разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз [c.148]

Применение хроматографических методов разделения нуклеиновых кислот и специфических эндонуклеаз основано на использовании с этой целью их разницы в молекулярных весах, значений и величин заряда. Учитывая определенную избирательность используемых с этой целью хроматографических материалов и то, что большая часть процессов по разделению нуклеиновых кислот и специфических эндонуклеаз осуществляется в одной стадии в колоночном режиме, следовало бы ожидать совмещения решения вышеуказанной задачи с определенной как функциональной, так и абсолютной очисткой рестриктаз от сопутствующих примесных нежелательных активностей и белков. [c.148]

Наиболее простым хроматографическим приемом разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз следует признать гель-фильтрацию бесклеточного экстракта. Эта процедура примени- [c.148]

Все этапы выделения рестриктаз (в том числе и центрифугирование гомогената разрушенных клеток), в зависимости от условий их проведения, могут дать в той или иной мере выраженную очистку целевых ферментов. Это замечание относится и к методам, применяемым для разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз. Однако, в связи с отмеченной выше важностью этой процедуры для препаративной биохимии обсуждаемых ферментов по методологическим соображениям уместным является ее рассмотреть отдельно. [c.143]

Процедура разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз с использованием ДЭАЭц проводится в двух вариантах 1) при значениях ионной силы, исключающих задерживание на сорбенте целевого фермента и не препятствующих сорбции на нем нуклеиновых кислот — в условиях, обеспечивающих разделение целевых ферментов и нуклеиновых кислот уже во время контакта грубых экстрактов с анионитом 2) в условиях, когда оба компонента связываются анионитом и их разделение осуществляется при последующей элюции с колонки. [c.150]

В завершение обсуждения методических приемов, используемых для разделения нуклеиновых кислот и рестриктаз, хотелось бы обратить внимание на некоторые вопросы. Взаимодействие рестриктаз и нуклеаз — основных интересующих исследователя компонентов грубого экстракта, с нуклеиновыми-кислотами, вносит ощутимый вклад в результаты экспериментов. Использование высокой ионной силы позволяет исключить-этот фактор в случае гельфильтрации и высаждения нуклеиновых кислот при помощи ПЭИ. Однако в этих условиях в общем случае должен наблюдаться переход во фракцию, содержащую рестриктазы, неспецифических нуклеаз. Поэтому, если цель эксперимента сводится не просто к разделению нуклеиновых кислот и рестриктаз, а к определенной функциональной очистке целевого фермента, более привлекательным является использование таких приемов, которые позволяют варьировать ионную силу. Перспективным в этом отношении является применение катионитов. При взаимодействии грубых экстрактов с катионитами нуклеиновые кислоты в общем случае должны оказаться в несорбированной фракции. Проведение процесса в условиях низкой или умеренной ионной силы призвано обеспечить удаление вместе с нуклеиновыми кислотами и определенной части иеспецифических нуклеаз. Хотя это специально и не оговорено, данные об эффективной функциональной очистке более десяти рестриктаз по схеме, разработанной Грин с соавт. [109], прошедших, вслед за стадией фракционирования грубых экстрактов на ФРП, хроматографию на ГАП, косвенно подтверждает это предположение. [c.153]

В большинстве случаев выделения гомогенных препаратов рестриктаз для удаления нуклеиновых кислот используется их высаждение при помощи СС или ПЭИ [13, 72, 106, 107, 127, 138, 184, 299, 234], что, учитывая простоту масштабируемости этого приема, является вполне понятным. Имеются примеры использования для разделения нуклеиновых кислот и целевых ферментов на первой стадии препаративных опытов сорбентов, в том числе ФРП [29, 34, 80, 254], гепаринсефарозы [196] голубой сефарозы [33] и ДЭАЭц [74]. В цитированных случаях только в случае выделения Bgl I [163] грубые экстракты перед нанесением на сорбенты подвергались высаливанию. [c.166]

Фракционирование нуклеиновых кислот путем электрофореза в агарозе — это наиболее удобный метод анализа как ДНК так и РНК. В данной главе изложен метод электрофоретического разделения ДНК, предварительно обработанной рестриктазами. Метод основан на том, что скорость миграции линейных молекул ДНК в электрическом поле пропорциональна их. длине. Таким образом, можно довольно легко разделить фрагменты ДНК разной длины, а также определить размер, сравнивая скорость их миграции в геле с маркерными ДНК известного размера. Полосы ДНК видны при освещении ультрафиолетом после окрашивания геля флуоресцирующим интеркали-рующим красителем бромистым этидием в низкой концентрации. Такой метод окрашивания обладает большой чувствительностью и позволяет обнаруживать зоны, содержащие всего [c.280]

Основными этапами выделения любой рестриктазы является получение бесклеточных экстрактов и собственно очистка целевых ферментов, осуществимая с применением традиционных приемов препаративной биохимии белковых соединений (высаливание, хроматографическое фракционирование и т. д.). Вместе с тем следует отметить, что процессам выделения рестриктаз, как и других ферментов нуклеинового обмена, характерен ряд специфических особенностей. В первую очередь это замечание относится к тому вниманию, которое уделяется разделению целевых ферментов и нуклеиновых кислот, в принципе способных влиять на перераспределение как рестриктаз, так и нуклеаз между фракциями, получаемыми в результате применения различных методов выделения целевых ферментов. Поэтому этот этап является одним из ключевых в схемах выделения рестриктаз, от результатов проведения которого во многом зависит успех дальнейшей их очистки. [c.143]

Учитывая большую разницу в величине заряда белков (рестриктаз) и нуклеиновых кислот в общем случае и его знака в некоторых условиях, вполне понятным является привлечение для решения задачи разделения указанных компонентов ионитов. В одной из первых работ применения с этой целью сорбентов, содержащих ионогенные группы, был использован ГАП 253], на который путем непродолжительного перемешивания с грубыми экстрактами ряда продуцентов из рода Haemophilus сорбировали рестриктазы и нуклеиновые кислоты. Фракционное промывание сорбента порциями элюирующих растворов повышающейся ионной силы позволило добиться отделения нуклеиновых кислот от целевых ферментов и достичь более чем десятикратной очистки последних. Однако, этот прием в дальнейшем не получил распространения, так как для решения обсуждаемых задач были подобраны более удобные в работе сорбенты. В качестве такого, хотя и редко, используется анионит ДЭАЭц. [c.150]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология