Хроматография белков ферментативных

Рис. 4-47. Типичные результаты, полученные при очистке белка различными методами хроматографии. В данном случае подлежащий фракционированию клеточный экстракт сначала пропускали через колонку, заполненную ионообменной смолой (А). Затем колонку промывали и связавшиеся белки элюировали раствором, содержащим постепенно нарастающую концентрацию соли. Белки с наименьшим сродством к ионообменной смоле проходят через колонку не задерживаясь и собираются со дна колонки в первых порциях элюата. Остальные белки элюируются соответственно сродству к ионообменной смоле. Для элюирования белков, связывающихся со смолой наиболее сильно, требуется наивысшая концентрация соли. Исследуемый белок элюировался в виде узкого пика он был выявлен по ферментативной активности. Фракции с такой активностью собирали и наносили на вторую колонку для гель-фильтрации (Б). Фракцию все еще недостаточно очищенного белка выявляли по ферментативной активности активные фракции собирали и очищали до гомогенного состояния на колонке (В), содержащей иммобилизованный

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе. ДЭАЭ-целлюлозу подготавливают в соответствии с инструкцией (с. 109), заполняют колонку (3x25 см) и уравновешивают буфером (реактив № 2). Наносят раствор белка и проводят элюцию в линейном градиенте того же буфера, содержащего О—0,3 М КС1. Скорость элюции — 90 мл/ч. Собирают фракции по 9 мл, определяют в них содержание белка и ферментативную активность. Фракции, в которых обнаружена активность гексокиназы, объединяют и проводят повторную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. Для этого подготавливают колонку размером 1,4X15 см. Белок элюируют буфером (реактив 2) (около 200 мл), содержащим О—0,3 М КС1. Скорость элюции — 35 мл/ч. Собирают фракции по [c.218]

Еще одна проблема - невысокая стабильность белков, кодируемых клонированными генами. Рекомбинантный белок может расщепляться про-теиназами хозяйской клетки. Чтобы избежать этого, можно изменить клонированный ген таким образом, чтобы на N-конце белковой молекулы оказались одна или несколько дополнительных аминокислот. В такой форме рекомбинантный белок уже не подвергается столь быстрой деградации. Кроме того, лишние аминокислоты иногда помогают в последующей очистке химерного белка, например с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке. При этом место соединения компонент подбирается так, чтобы по нему можно было расщепить молекулу (химическим или ферментативным путем) и получить эти компоненты в чистом виде. [c.130]

Высокоэффективным методом разделения является сочетание электрофореза на бумаге с обычной хроматографией. При этом сначала через влажную бумагу, на которую нанесена смесь, пропускают ток высокого напряжения, а затем смесь хроматографируют с помощью подходящего растворителя в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. В результате достигается разделение первоначальной смеси в двух измерениях. Применение такого метода к продуктам ферментативного расщепления белков позволяет получить двухмерную картину, которую называют пептидной картой. Каждый белок дает характерную для него при каждом конкретном способе расщепления картину. Локализацию отдельных компонентов во многих случаях определяют с помощью специфических красителей. При определении аминокислот и пептидов в качестве такого красителя используют, например, нингидрин. Если производится элюция адсорбированных компонентов, то удобнее всего устанавливать их присутствие в элюате спектрофотометрически. Вероятно, наиболее тонким методом разделения белков следует считать иммуноэлектрофорез, при котором эффект достигается за счет использования различий в двух свойствах электрофоретической подвижности и иммунологической специфичности. [c.220]

На следующем этапе исследования белок подвергают ферментативному гидролизу на пептиды, например под действием трипсина, химотрипсина и пепсина. Разделение пептидов осуществляют с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге. Затем, пользуясь ДНФБ-методом, определяют аминокислотную последовательность, начиная с Ы-конца. [c.289]

Другой областью применения гель-хроматографии в биохимии является отделение белков от низкомолекулярных мешающих анализу примесей, например аминокислот, сахаров, стероидов или реагентов, используемых для химической модификации белка. Методом гель-хроматографии чаще всего удаляют реагенты, предназначенные для введения в белок радиоактивной и флуоресцентной меток. Гель-хроматография позволяет также быстрее и эффективнее, чем диализ, осуществить обессолива-ние или смену буфера, требуемые в определенных схемах фракционирования, а также удаление кофакторов и ингибиторов, используемых при изучении кинетики ферментативных реакций. Кроме того, с помощью этого метода можно изучать связывание белков с низкомолекулярными соединениями, например лекарственными веществами, ионами металлов и красителями [10]. Коэффициент распределения Ка некоего стандартного белка с из- [c.106]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология