Гибридная плазмида

Для отбора клеток, содержащих рекомбинантную ДНК, используют специальные приемы. Чтобы уменьшить количество кольцевых плазмидных молекул, образующихся ири сшивании фрагментов ДНК-лигазой Т4, рестрицированную плазмидную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой, удаляющей 5 -концевые фосфатные группы. Для отбора трансформированных клеток, содержащих гибридные плазмиды, проводят 1) тестирование на резистентность к определенным антибиотикам или колориметрическую реакцию 2) иммунологические тесты или выявление специфического белка - продукта клонированного гена 3) гибридизацию с зондом, комплементарным како-му-либо участку искомого гена. [c.78]

Некоторые микроорганизмы обладают природной способностью к деградации различных ксенобиотиков, однако следует иметь в виду, что 1) ни один из них не может разрушать все органические соединения 2) некоторые органические соединения в высокой концентрации подавляют функционирование или рост деградирующих их микроорганизмов 3) большинство очагов загрязнения содержит смесь химикатов, и микроорганизм, способный разрушать один или несколько ее компонентов, может инактивироваться другими компонентами 4) многие неполярные соединения адсорбируются частицами почвы и становятся менее доступными 5) биодеградация органических соединений часто происходит довольно медленно. Часть этих проблем можно решить, осуществив конъюгационный перенос плазмид, которые кодируют ферменты разных катаболических путей, в один реципиентный штамм (рис. 13.5). Если две плазмиды содержат гомологичные участки, то между ними может произойти рекомбинация с образованием гибридной плазмиды, которая имеет больший размер и обладает свойствами исходных плазмид. Если же две плазмиды не содержат гомологичных участков и относятся к разным группам несовместимости, то они могут сосуществовать в одной бактерии. [c.276]

Рис. 13.5. Создание бактериального штамма, способного разрушать камфару, октан, ксилол и нафталин. Штамм А, несущий плазмиду САМ (она детерминирует разрущение камфары), скрещивают со штаммом В, несущим плазмиду ОСТ (разрущение октана). При этом образуется штамм Е, который содержит гибридную плазмиду, образовавшуюся в результате гомологичной рекомбинации между исходными плазмидами и обладающую функциями каждой из них. Штамм С, содержащий плазмиду XYL (разрушение ксилола), скрещивают со штаммом D, содержащим плазмиду NAH (разрушение нафталина), и получают штамм F, который несет обе эти плазмиды. Наконец, скрещивают штаммы Е и F, в результате чего образуется штамм G, содержащий плазмиды САМ/ОСТ, XYL и NAH.

Хозяин может отдать одну из своих собак другому, так и бактерии способны обмениваться плазмидами. Вот это свойство плазмид легко переходить из рук в руки , доставляющее столько хлопот медикам, оказалось как нельзя кстати для генных инженеров. Если плазмиды извлечь из бактерий, вставить в них чужую ДНК, а затем примешать такие гибридные плазмиды к бактериальным клеткам, то по крайней мере часть гибридов будет успешно размножаться в бактериях. Иными словами, благодаря крайней простоте своего устройства плазмиды оказались теми организмами, которые легко переносят хирургическое вмешательство — встройку в них чужеродных генов. Более сложные организмы, даже вирусы, такую операцию переносят гораздо болезненнее. [c.61]

Используя рестриктазы, получают гибридные плазмиды, содержащие -фрагменты ДНК из любых организмов. Затем [c.61]

Для того чтобы генетическая информация гибридной плазмиды могла проявиться, необходим белоксинтезирующий аппарат бактериальной клетки. Поэтому плазмиду вводят в бактериальную клетку путем трансформации (см. выше). Если гибридная плазмида будет представлена в клетке в большом числе копий, то чужеродная ДНК будет многократно воспроизводиться вместе с плазмидой. Потомство клетки, содержащей гибридную ДНК, генетически однородно-оно образует клон. [c.470]

Многие плазмиды несут гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам. Это оказывается полезным при создании клонирующих систем. Обычно используют плазмиду, несущую два гена, обеспечивающих устойчивость к разным антибиотикам. Один из них служит просто для идентификации бактерий, несущих плазмиду, путем отбора клеток, устойчивых к антибиотику. Другой служит для того, чтобы отличить гибридную плазмиду от родительского вектора. Если сайт встраивания чужеродной ДНК находится внутри такого гена, гибридная плазмида теряет устойчивость к антибиотику. Таким образом, селекция родительского вектора может производиться по признаку устойчивости к двум антибиотикам, в то время как отбор гибридной плазмиды может основываться на сохранении устойчивости к одному антибиотику и чувствительности-к другому. [c.237]

Развитие методов генной инженерии привело к разработке системы трансформации для дрожжей, что способствовало более глубокому изучению у них механизма рекомбинации. Гибридные плазмиды, содержащие участки дрожжевой ДНК с известными маркерами, клонированные на векторе Е. соИ, могут быть введены в клетки дрожжей. При этом может происходить встраивание плазмидной ДНК в хозяйскую хромосому за счет рекомбинации между гомологичными последовательностями хромосомы и участка дрожжевой ДНК, входящего в состав плазмиды. При использовании плазмидной ДНК в замкнутой кольцевой форме удается с заметной частотой отобрать трансформированные дрожжевые клетки. В то же время введение двухцепочечного разрыва в дрожжевую [c.150]

При участии других ферментов, называемых лигазами, комплементарные участки можно соединить, создавая гибридные плазмиды, в которые [c.507]

За последние годы в селекции продуцентов аминокислот активно начали использовать методы генной инженерии, позволяющие повышать дозу генов биосинтеза аминокислот путем их клонирования на плазмидах. Трансформируя гибридные плазмиды в клетки, удается повысить дозу генов и, следовательно, количество ферментов, ответственных за биосинтез соответствующей аминокислоты. [c.21]

Единственным методом введения гибридных плазмид является трансформация сферопластов, полученных после обработки клеток лизоцимом. Клеточная стенка должна быть при этом подготовлена предварительным выращиванием клеток на среде с пенициллином и глицином. Для каждого штамма требуется оптимизация условий получения сферопластов и их регенерации. В лучших экспериментах частоты трансформации достигают 10 —10 трансформантов на 1 мкг ДНК. [c.174]

Получение гибридных плазмид, содержащих любые фрагменты ДНК, основывается на применении рест-jDUKraa — ферментов, узнающих короткие последовательности ДНК и разрезающих молекулы ДНК в соответствующих местах. Гибридные плазмиды клонируют — размножают — вместе с бактериями, в которые они введены. [c.268]

На втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки, выросшие на среде с ампициллином, переносят на среду с тетрациклином методом перепечатки. Клетки, образующие колонии на чашках с тетрациклином, содержат интактную плазмиду рВК322, поскольку, как мы уже говорили, они устойчивы и к ампициллину, и к тетрациклину. Клетки, не выросшие на чашках с тетрациклином, чувствительны к этому антибиотику, значит, они содержат гибридную плазмиду рВК322. [c.60]

Оказавшись в бактериальной клетке, линейная молекула pLFR-5 со вставкой замыкается в кольцо благодаря спариванию os-сайтов. В такой стабильной конфигурации она может долгое время существовать в клетке и реплицироваться как гибридная плазмида, поскольку содержит все необходимые для этого элементы. Более того, ген устойчивости к тетрациклину обеспечивает рост колоний, несущих данную космиду, на среде с этим антибиотиком нетрансформированные клетки при этом погибают. Существуют и другие космидные векторы на основе фага X. [c.76]

Структурное разнообразие TOL-плазмид размером от 115 до 270 тыс. п. н., кодирующих одну и ту же катаболическую функцию, объясняется тем, что последовательность ДНК, кодирующая ферменты деградации, может быть перенесена из одного репликона в другой. Однако единой единицы транспозиции не существует. Несколько исследований на независимо выделенных плазмидах устойчивости — tol-гибридах — обнаружили щирокую вариабельность в количестве TOL-ДНК, присутствующей в гибридных плазмидах. В tol-участке имеется два молекулярных компонента [672] сегмент в 56 тыс. п. н., кодирующий tol-гены, который ведет себя подобно транспосибельным элементам [683, 684], и сегмент в 39 тыс. п. н., ограниченный повторяющимися последовательностями длиной 1400 п. н., который способен к точному вырезанию [685]. [c.328]

Внесение разрыва в один из участков кольцевой плазмидной ДНК преврашает ее в линейную молекулу, как показано на рис. 19.1. Затем два конца этой молекулы могут быть присоединены к концам линейной молекулы чужеродной ДНК, что приводит к образованию кольцевой гибридной плазмиды. Формально не сушествует ограничений на длину встраиваемой в плазмиду чужеродной ДНК. Гибридная плазмида может сушествовать в бактериальной клетке неограниченно долгое время. Для выделения гибридной плазмиды из клетки, например с помощью гель-электрофореза, можно использовать такие ее свойства, как размер или кольцевое строение. [c.237]

Другая система предоставляет возможность для выделения дискретных точек начала репликации. Клетки дрожжей S. erevisiae, мутантные по какой-то функции, могут быть трансформированы путем добавления ДНК, которая несет копию гена дикого типа. Схема эксперимента представлена на рис. 31.13. Мутация клетки-хозяина должна затрагивать ген, продукт которого можно селектировать. ДНК клеток дикого типа выделяют, фрагментируют и клонируют в составе плазмид Е. oli. Гибридные плазмиды инкубируют с мутантными клетками дрожжей в таких условиях, в которых эти клетки способны выжить только в случае экспрессии гена дикого типа. В зависимости от частоты возникновения трансформированных клеток различают два типа трансформации. [c.403]

Далее была предпринята попытка усилить сверхпродукцию треонина, увеличив число копий мутантного треонинового оперона в клетке Е. oli путем клонирования этого оперона в составе многокопийной гибридной плазмиды. Полный треониновый оперон клонировали на плазмиде-векторе рВР322. Гибридная плазмида, трансформированная в Е. соИ К12, существовала в микроорганизме стабильно (20 копий в клетку). Приблизительно во столько же раз в клетке увеличилось и количество ферментов, кодируемых треониновым опероном. Количество треонина, синтезируемого такими клетками Е. соИ, достигало 20—30 г/л. Это в два-три раза превышало лучшие мировые достижения того времени. [c.110]

Получение продуцентов пролина методами генной инженерии. Этот метод пока опробован на одном объекте — Е. oli. На первом этапе получают мутантные штаммы, устойчивые к аналогам пролина, которые используют в качестве доноров ДНК-Затем пролиновый оперон, содержащий три гена, клонируют на плазмиду и гибридную плазмиду вводят в реципиентный штамм. Полученные плазмидные штаммы продуцируют в 2—3 раза больше пролина, чем соответствующие бесплазмидные мутанты. Продукция пролина может, достигать у плазмидных продуцентов 27 г/л за 48 ч. [c.23]

Ярким примером создания микроорганизма с помощью переноса природных плазмид служит получение штамма Ps. putida, способного утилизировать большинство основных углеводородов нефти. Многие псевдомонады несут плазмиды, каждая из которых кодирует ферменты, необходимые для расщепления одного-единственного класса углеводородов. Плазмида ОСТ обусловливает расщепление октана, гексана и декана, плазмиды XYL — ксилола и толуола, САМ — камфоры, NAH — нафталина. Две из этих плазмид, САМ и NAH, являются конъюгативными, а две другие, ОСТ и XYL, мобилизуются указанными плазмидами. В результате последовательных скрещиваний был получен штамм Ps. putida, несущий плазмиды XYL и NAH и гибридную плазмиду, вероятно, коинтеграт, содержащий плазмиды ОСТ и САМ (рис. 12). Такая мультиплазмидная бактерия энергично растет, усваивая неочищенную нефть, поскольку она утилизирует гораздо больше углеводородов, чем любая бактерия с одной плаэ- [c.93]

Хотя векторы, несушие два (или более) селектируемых маркера, и позволяют в большинстве случаев отбирать бактерии, содержащие гибридные плазмиды, по инактивации одного из маркеров, однако для этого требуется перенос клонов трансформантов с одной среды на другую методом отпечатков. Это трудоемкая операция, особенно при анализе большого числа клонов. Поэтому в настоящее время сконструированы векторы, позволяющие производить прямой отбор клонов, несущих гибридные молекулы. Для этого в векторную молекулу вводят ген, выражение которого в определенных условиях вызывает гибель кпетки. Инактивация этого гена путем интеграции в него чужеродной ДНК делает трансформанты, содержащие гибридные л-олекулы, жизнеспособ- [c.145]

У плазмид на основе репликона olEI есть и недостатки. Одним из них является снижение числа копий на клетку при увеличении молекулярной массы гибридной плазмиды. Для плазмид этого типа выход рекомбинантов падает с ростом молекулярной массы вставки. Это обстоятельство делает малоэффективным клонирование в плазмидах фрагментов ДНК, превышающих 10 Т.П.О. Для клонирования фрагментов большей длины используют фаговые векторы, космиды и фазмиды. [c.146]

В этот вектор также вставлен межгенный район однонитевого фага М13. При лизисе клеток, содержащих такую гибридную плазмиду (фазмиду), и суперинфицированных специальным фагом-помощником М13, образуются гибридные однонитевые ДНК в высоком титре (и в том числе клонированный ген), которые могут быть использованы для определения последовательности оснований. Преимущество такой конструкции перед фагом [c.153]

В том случае, когда ожидается с высокой вероятностью экспрессия клонированного гена, методы скрининга рекомбинантных клонов основываются либо на изменении фенотипа клетки под влиянием вновь синтезированного белка, либо просто на свойствах самого белка. Например, если необходимо изолировать гены Е. соИ, ответственные за биосинтез какой-либо аминокислоты, то отбирают рекомбинантные клоны, трансформируя гибридные плазмиды в ауксотрофные по биосинтезу аминокислот мутанты и получая прототрофные клоны. Это и есть тест на комплем 1и тацию. Прием очень удобный, но он исполь зуетея-ТУбычнопри самоклонировании , т. е. при переносе генов на многокопийных плазмидах в тот же микроорганизм, и требует наличия штаммов с хорошо охарактеризованными мутациями искомых генов. [c.154]

С появлением методологии генной инженерии метод локализованного мутагенеза становится доступным для широкого круга микроорганизмов. В наиболее простом варианте клонированный фрагмент ДНК, ограниченный удобными сайтами рестрикции, может быть выделен и подвергнут мутагенезу in vitro. Вследствие проведения реакции in vitro дозы мутагена могут быть достаточно высокими, что сильно повышает частоту мутагенеза. Такой подход использован при создании штамма-продуцента гомосерина (см. гл. 4). Для получения стабильных неревер-тирующих мутаций в определенном гене можно применить метод инсерционного локализованного мутагенеза. С этой целью инактивируемый ген клонируют на плазмиде и встраивают в него детерминант устойчивости к антибиотику (рис. 29). Затем компетентные клетки трансформируют сконструированной гибридной плазмидой (или полученной при ее расщеплении линейной молекулой ДНК), содержащей указанный детерминант, фланкированный последовательностями, гомологичными хромосомному гену. В результате двойного кроссинговера происходит интеграция гена лекарственной устойчивости в гомологичный район хромосомы. Искомые трансформанты отбирают на селективных [c.160]

Смотреть страницы где упоминается термин Гибридная плазмида: [c.268] [c.59] [c.60] [c.60] [c.61] [c.70] [c.248] [c.279] [c.62] [c.470] [c.404] [c.57] [c.151] [c.149] [c.211] [c.506] [c.107] [c.28] [c.104] [c.136] [c.166] [c.171] [c.172] [c.172] [c.176] [c.177]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология