Функциональная комплементация

Выделение мутантов имело огромное значение для изучения гена. До недавнего времени гены можно было идентифицировать только по мутациям, которые оказывались летальными или же блокировали развитие некоторого видимого или измеримого фенотипического признака. В результате картирования мутаций возникло предположение, что группа мутаций, нарушающих один и тот же признак, может быть тесно сцеплена, а использование теста на комплементацию показало, что каждая такая группа составляет функциональную генетическую единицу. Какова же природа этих мутаций [c.37]

Генетический анализ состоит в экспериментальном изучении отношений, существующих между мутантами. Для определения характера этих отношений используются два основных приема,-рекомбинационный тест и тест на комплементацию. Рекомбинационный тест, как мы уже отмечали в предыдущем разделе, определяет взаимное пространственное расположение мутаций на генетической карте. Комплемента-ционный тест, с другой стороны, определяет функциональные отношения мутантов. Все -//-мутанты обладают одинаковым фенотипом (табл. 6.1). Одинаковы ли их генетические функции Для ответа на этот вопрос клетки Е. соН К (А) заражали различными парными комбинациями мутантов гП, как это схематически изображено на рис. 6.6. Если в такой дважды инфицированной клетке возникает потомство фага, то это означает, что каждый из двух мутантных фагов осуществляет функцию, которую не в состоянии осуществлять второй мутант. Такие два мутанта называют комплементарными. С другой стороны, если в такой дважды инфицированной клетке потомства фагов не возникает, то это означает, что оба мутанта не способны осуществлять одну и ту же функцию. [c.166]

Температурно-чувствительные мутанты можно подразделить на функциональные группы с помощью теста комплементации, факторы, влияющие на комплементацию, детально изучены [37, 38]. [c.158]

A. Описанный здесь тест с кружками - это разновидность классического теста на комплементацию, который позволяет решить, дефектны два мутанта по одному и тому же гену или по разным генам. Если пара мутантов дефектна по одному и тому же гену, они не могут помочь друг другу при инфицировании (так как им обоим недостает продукта одного и того же гена) и, следовательно, при смешанной инфекции они растут не лучше, чем порознь. Напротив, если два мутанта имеют дефекты в разных генах, они могут помочь друг другу в смеси будет присутствовать по крайней мере одна функциональная копия каждого гена, и, следовательно, они смогут расти как смесь мутантов. [c.303]

Большой интерес для генетической инженерии представляет достижение правильной экспрессии клонированной генетической информации в клетках-реципиентах. Экспрессию легко выявить, если клонируемый ген при правильной транскрипции и трансляции обеспечивает функциональную комплементацию мутаций генома клетки. В этом случае нужный гибрид может быть обнаружен простым отбором трансформированных клонов на селективной среде. Например, в одной из первых работ такого типа, выполненной в 1976 г в лаборатории Р. Дэвиса, выяснилось, что гибридная ДНК, полученная при встройке определенных фрагментов хромосомной ДНК дрожжей-сахаромицетов в ДНК векторного фага Я, комплементирует мутацию Е. соН hisB. Клоны, содержащие такие гибриды, отбирали по способности клеток расти на питательной среде без гистидина. В дальнейшем данный подход неоднократно использовался при попытке клонировать чужеродные гены. [c.35]

Одним из приоритетных направлений ген-но-инженерных исследований является достижение правильной экспрессии генов высших эукариот и их вирусов в бактериальных клетках. Однако в данных случаях экспрессию многих клонированных генов уже нельзя выявить по функциональной комплементации в силу некоторых принципиальных различий в организации прокариотических и эукариотических клеток. Несомненно, такой подход неприменим и при клонировании большинства вирусных генов. Поэтому в данной ситуации для поиска требуемых клонов гибридов можно использовать метод радиоиммуноанализа белков in situ, первые варианты которого были описаны в 1978 г. В основу метода (рис. 1.21) положена способность молекул иммуноглобулинов связываться с полистиролом или поливинилом. Кроме того, предполагается, что исследуемый белок имеет не менее двух антигенных детерминант и может связывать по крайней мере две разные молекулы иммуноглобулинов, присутствующих в препарате поликлональных антител, полученных на целевой белок. [c.35]

Таблица 4.1. Некоторые хромосомные гены низших эукариот, выявляемые функциональной комплементацией соответствующих генов Е. oli

Дрожжевые гены наиболее просто клонировать и отбирать по функциональной комплементации мутантных клеток. Причем при внедрении клонируемых генов в многокопийные векторные плазмиды за счет повышенной дозы гена обычно наблюдается суперпродукция соответствующего дрожжевого белка (такой белок гораздо проще выделить в чистом виде и изучить его свойства). [c.311]

Какие химические процессы лежат в основе супрессии (подавления) одной мутации другой мутацией, локализованной в иной точке хромосомы Однозначного ответа на этот вопрос дать нельзя. Редко мутация супрессируется другой мутацией, локализованной в пределах того же самого гена. Такой эффект может быть назван внутригенной комплементацией. Предположим, что мутация приводит к такой аминокислотной замене, которая нарушает стабильность структуры или функцию белка. Возможно, что мутация в другом сайте, захватывая остаток, взаимодействующий с замещенной аминокислотой, меняет характер взаимодействия двух остатков, что приводит к восстановлению функциональной активности белка. Так, например, если боковая цепь первой аминокислоты мала, а в результате мутации она замещается на более длинную боковую цепь, то вторая мутация, приводящая к уменьшению размера другой боковой цепи, может позволить образующемуся белку свертываться и функционировать подобно нормальному белку. Такой случай был обнаружен среди мутантов триптофансинтетазы [144]. Мутанты этого белка, у которых Gly-211 был заменен на Glu нли Туг-175— на ys, синтезировали неактивные ферменты, тогда как двойной мутант, т. е. мутант, в котором имели место обе эти замены, синтезировал активную триптофансинтетазу. Считают, что в большинстве случаев внутригенной супрессии происходят изменения во взаимодействии субъединиц олигомерных белков. [c.255]

Использование бензеровского комплементационного анализа для других участков генома Т-четных фагов показало, однако, что получаемые результаты не всегда столь однозначны, как это было при исходном определении генов А и В в области гН. Распределение ат-мутантов по генам было однозначным, однако Эдгар и Эпштейн обнаружили ряд 1з-щ-таций, которые, судя по их положению на генетической карте и по результатам функционального цис-транс-теста с тесно сцепленными ат-иу-тантами, должны относиться к одному и тому же гену, но тем не менее дают в цис-транс-тесте хорошую комплементацию. Аналогичные случаи внутригенной комплементации были вскоре обнаружены в работах по установлению генетической единицы функции в геноме бактерий и других организмов. [c.314]

Существование внутригенной комплементации на самом деле не снижает основной ценности определения гена, данного Бензером. Ее легко объяснить, исходя из представления о четвертичной структуре белков. Как мы уже видели в гл. IV, многие белки осуществляют свою биологическую функцию лишь в том случае, если они находятся не в виде отдельной полипептидной цепи, а в составе четвертичной структуры, образованной из двух или большего числа полипептидных цепей. Так, мы уже упоминали, что Р-галактозидаза представляет собой агрегат, состоящий нз четырех идентичных полипептидных цепей. Рассмотрим теперь /5-мутацию в гене, определяющем белок, который проявляет свою ката-.литическую активность, лишь находясь в форме комплекса, построенного из четырех идентичных полипептидных цепей. В этом случае мутантный фенотип 1з, очевидно, возникает в результате появления в одном из участков мутантной полипептидной цепи неподходящей аминокислоты. Вследствие этого интервал температур, в котором агрегат, состоящий из четырех цепей, может принимать физиологически активную четвертичную структуру, оказывается суженным. Это значит, что, хотя при пермиссив-ной температуре 25 °С такой агрегат сохраняет свою активность, при 42 °С он денатурирует. Допустим теперь, что в одной и той же клетке присутствуют две копии гена, определяющего рассматриваемый белок, и, как в цис-транс-тесте, эти копии несут разные мутации. Тогда должны возникнуть гибридные агрегаты мутантного белка, из четырех полипептидов которого часть синтезирована под контролем одного, а часть — под контролем другого /5-мутантного гена. В этом случае существует возможность, что интервал температур, в котором гибридный мутантный агрегат образует функционально активную структуру, окажется шире интервала температур для образования функционально активных агрегатов, состоящих только из одного типа мутантных полипептидов. Это значит, что два разных замещения аминокислот в первичной структуре белка, вызванные двумя й-мутациями, могут привести к взаимной компенсации. В результате такой компенсации агрегат из мутантных полипептидов, так же как и белок дикого типа, сохраняет стабильность в широком интервале температур. [c.314]

Внутригенная комплементация наблюдается и при обычных мутациях с потерей функции (см. гл. VI). В этом случае два мутанта по одному и тому же гену синтезируют каждый по полипептидной цепи, не обладающей функциональной активностью ни п/ м каком температуре. Ком-плементируя друг с другом, они образуют функционально активные гибридные четвертичные структуры. Тот факт, что Бензер не обнаружил никакой внутригенной комплементации в своей большой коллекции гП-мутантов, дает основание думать (хотя и не доказывает это), что биологическая активность белковых продуктов генов гИА и гПВ обусловлена [c.314]

Использованный Бензером тест на комплементацию оценивает функциональные отношения между мутациями, находяпдамися в транс-кон-фигурации (рис. 6.8). Если две мутации принадлежат к одной группе комплементации и находятся в шранс-положении, то они не комплемен-тируют и потомства не возникает. С другой стороны, если эти же две мутации находятся в t/мс-положении, то потомство образуется. Например, если бактериальную клетку штамма К(Х.) одновременно заражают двойным -//-мутантом и фагом Т4 дикого типа, то образуется потомство обоих генотипов. Фаг дикого типа осушествляет функции, необходимые для успешной репликации как генома дикого типа, так и мутантного генома. Если же две мутации относятся к разным группам комплементации, то и в цис-, и в транс-положениях они проявляют одинаковый фенотип потомство возникает в обоих случаях. [c.168]

Учитывая важность цис-транс-теста для определения функциональной генетической единицы, Бензер предложил для обозначения групп комплементации г//-мутаций термин цистрон . С тех пор употребление термина цистрон в качестве синонима гена (как единицы функции) стало общепринятым. [c.170]

Многие белки представляют собой олигомеры, т. е. состоят из двух или нескольких идентичных полипептидных цепей, взаимодействующих между собой с образованием функционально активной четвертичной белковой структуры. В простейшем случае это-димер (аг), состоящий из двух одинаковых субъединиц (а). Это обстоятельство может осложнять комплементационный анализ мутантных структурных генов, кодирующих такие белки. Ранее при обсуждении опытов по комплементации мы исходили из того, что комплементация невозможна при наличии в диплоиде двух гетероаллельных мутаций, вызывающих различные аминокислотные замены, каждая из которых независимо инактивирует соответствующий полипептид (см. главу 6). Для примера рассмотрим случай, когда оба мутантных аллеля, т и Ш2, в условиях гомозиготно-сти приводят к некоторому мутантному фенотипу (например, к отсутствию определенной ферментативной активности). На основании сформулированных ранее представлений следовало бы полагать, что поскольку обе мутации затрагивают один и тот же ген, то и двойные гетерозиготы типа т +1 + т также будут иметь мутантный фенотип. В большинстве случаев, в том числе и для генов, кодирующих олигомерные белки, это действительно так. В то же время известно и доста- [c.30]

На рис. 10.22 схематически показано, как взаимодействие двух мутантных полипептидных цепей может привести к восстановлению активного центра фермента и таким образом обеспечить внутригенную комплементацию. Некоторые гетероаллели данного гена могут проявлять способность к комплементации такого рода, а некоторые - нет. Это зависит в том числе и от локализации конкретных мутаций, которые в одном случае могут затрагивать участки полипептидной цепи, ответственные за взаимодействие между субъединицами, а в другом-области, не участвующие непосредственно в процессе олигомеризации, но существенные для проявления функциональной активности данного белка. [c.31]

Несомненным достижением в работе С. Бензера была разработка метода перекрывающихся делеций для внутригенного картирования, благодаря которому стало возможным насыщать генетическую карту мутациями. Он впервые перевел величины, измеряемые в генетическом анализе, в молекулярную размерность сопоставил их с мономерами молекулы ДНК. Итогом этой работы было разрешение кажущихся противоречий между критериями аллелизма. Стала очевидной их относительность, особенно в отношении рекомбинационного критерия аллелизма. Функциональный же критерий аллелизма сохраняет свою ценность с учетом возможности межаллельной комплементации (см. гл. 2), т. е. он также относителен и в строгом смысле должен применяться на достаточно большом статистическом материале. В дальнейшем будет показано, что относительность функционального критерия аллелизма выражается не только в случае комплементарности аллельных мутаций, но и в случае некомплементар-ности мутаций разных генов в оперонах (см. гл. 16). Таким образом, от моргановских представлений об однозначном соответствии результатов разных тестов (рекомбинационного и функционального) на аллелизм мы приходим к пониманию их относительности и необходимости комплексного применения. [c.380]

Последовательное применение генетического анализа и рас-щрфровка первичной структуры генов вскрыли неожиданный факт перекрывания генов у некоторых вирусов. Так, у ряда РНК-содержащих бактериофагов Е. соИ (R17, f2, MS2, Q ) были известны всего три гена репликазы, белка оболочки и созревания вирусной частицы. Мутации каждого гена, например у фага MS2, некомплементарны между собой, но комплементарны мутациям остальных двух генов. После расшифровки полной нуклеотидной последовательности РНК этих фагов на ней были локализованы все три гена. Однако обнаружена и четвертая группа мутаций, блокирующих лизис зараженной клетки. Эти мутации образовали самостоятельную группу комплементации, т. е. на основе функционального критерия аллелизма они были отнесены к самостоятельному гену, для которого уже не оставалось места на РНК бактериофага. Тем не менее путем исследования белкового синтеза in vitro с использованием РНК фага в качестве и РНК было выявлено реальное существование белка L размером в 75 аминокислотных остатков, кодируемого этим новым геном. Локализовать его удалось благодаря тому, что один из мутантов по гену лизиса нес нонсенс UGA, идентифицированный по взаимодействию с соответствующими супрессорными тРНК. У этого мутанта была расшифрована первичная структура РНК. Оказалось, что UGA возник в результате замены С на U в кодоне GA (Apr). Таким образом была установлена фаза считывания триплетов в гене ли- [c.404]

В специальную группу можно также выделить нуклеотидные последовательности ранних и других районов аденовирусов, папова-вирусов и герпесвирусов, которые клонированы в составе различных плазмидных векторов и обладают трансформирующим действием. Эти гены способны заменять по своему функциональному действию онкогены как ядерного , так и неядерного типа при тестировании их трансформирующей способности по комплементации с клеточными онкогенами при котрансформации нормальных клеток. [c.226]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология