Инициация рекомбинации

Модель двухцепочечного разрыва не умаляет важности образования гетеродуплексной ДНК, которая вероятно представляет собой единственный реальный способ взаимодействия двух дуплексных молекул. Однако, возлагая ответственность за инициацию рекомбинации на двухцепочечные разрывы, мы должны изменить наши представления о способности. клетки манипулировать с ДНК. [c.446]

На первый взгляд участие двухцепочечных разрывов в инициации рекомбинации кажется удивительным. Ведь [c.446]

Рис. 60. Схема предполагаемого участия нуклеазы Ree B D (экзонуклеазы V) в инициации гомологичной рекомбинации

Вторая группа способов внутренней инициации связана с использованием разрывов, или брешей, в одной из цепей двухнитевой ДНК. Эти перерывы непрерывности могут возникать в результате действия тех или иных нуклеаз на ДНК-матрицу появление разрывов обычно сопровождает процесс рекомбинации. Так или иначе свободный З -ОН-конец цепи ДНК может быть использован в качестве затравки для дальнейшего удлинения этой цепи. [c.266]

Рис. 60. Схема предполагав мого участия нуклеазы Re B D (экзонуклеазы V) инициации гомологичной рекомбинации

Механизм устойчивости ВКО к интерферону оставался неустановленным, пока не была обнаружена открытая рамка считывания K3L, кодирующая белок мол. массой 10,5 кДа. Этот белок содержит аминокислотную последовательность, гомологичную N-концевой части эукариотического фактора инициации elF-2a мол. массой 36,1 кДа. N-концевые области обоих белков содержат 87 практически идентичных аминокислотных остатков, причем в положении 51 в обоих случаях находится серин, который в elF-2a фосфорилируется активируемой интерфероном Р1-киназой, что приводит к ингибированию синтеза белка в обработанных интерфероном клетках. КЗЬ-белок действует как конкурентный ингибитор фосфорилирования elF-2a, обеспечивая устойчивость ВКО к интерферону, и если из генома ВКО удалить ген K3L или его часть, то вирус станет чувствительным к интерферону. С помощью ПЦР-мутагенеза гена K3L, находящегося в составе плазмиды, и последующей гомологичной рекомбинации между ДНК ВКО и плазмидой с целью замены КЗЕ-последо-вательности дикого типа модифицированным вариантом был сконструирован мутантный ВКО K3L . Этот штамм оказался в 10-15 раз более чувствительным к интерферону, чем штамм дикого типа (рис. 11.11). Эта работа является важным этапом на пути создания более безопасных ВКО-векторов. Последовательности, сходные с K3L, могут содержать и другие устойчивые к интерферону вирусы, что позволит с помощью де- [c.241]

В экспериментах со многими различными организмами выяснилось, что для инициации событий, из которых слагается общая рекомбинация. [c.303]

Общая, или гомологичная, рекомбинация характерна для всех живых организмов от вирусов и бактерий до многоклеточных эукариот. При гомологичной рекомбинации происходит обмен участками между гомологичными, т. е. очень похожими по последовательности, лтолекулами ДНК- Так, к сбщей рекомбинации относятся обмены между гомологичными хромосомами в мейозе у эукариот и рекомбинационная инициация репликации ДНК бактериофага Т4 (см. гл. ХП1). В первом приближении можно сказать, что гомологичная рекомбинация не создает принципиально новых последовательностей, а перетасовывает уже имевшиеся сходные варианты одной и той же последовательности (рис. 51). Чтобы подчеркнуть важность этого свойства, достаточно сказать, что при гомологичной рекомбинации между двумя сходными генами, кодирующими белок, оба рекомбинантных продукта оказываются не нарушенными, не происходит, например, сдвига рамки считывания, Другими словами, при гомологичной рекомбинации каким-то образом обеспечивается взаимное узнавание одинаковых (или очень сходных по последовательности) участков рекомбинирующих. молекул. Если же го.чологии нет, то и рекомбинация такого рода происходить не будет. [c.84]

Рекомбинация не заканчивается образованием полухиазмы. Эта структура должна быть еще соответствующим образом разрезана. Как это осуществляется у бактерий, до сих пор не вполне ясно. Возможно, за это ответственны те же нуклеазы рекомбинации, которые принимают участие в инициации обмена, например нуклеаза Re B D. Воз.можно, существуют специализированные ферменты, специфически разрезающие структуру Холидея. Такие ферменты удалось выделить из клеток, зараженных фагом Т4 или Т7. [c.92]

Суть его можно представить следующим образом (рис. 146). В результате первого раунда репликации возникают два дочерних гуплекса с одноцепочечными З -концами (как и при репликации генома фага Т7). Но геном Т4 характеризуется кольцевыми перестановками (см. рис. 134). Поэтому если клетка заражена несколькими фаговыми частицами, то концевая посаедовате чьность одной молекулы фаговой ДНК будет соответствовать внутреннему участку другой молекулы. При помощи специальных фагоспецифических белков одноцепочечный З -конец первой молекулы может внедриться во внутренний район другой молекулы в результате появляется затравка, способная обеспечить дальнейшее удлинение цепи. В конечном счете возникает молекула, которую можно рассматривать как разветвленный конкатемер. Отметим, что рекомбинационная инициация имеет место и тогда, когда клетка заражается единственной фаговой частицей (рекомбинация в этом случае происходит между одинаковыми дочерними молекулами.) [c.279]

Если вектор представляет собой плазмиду, реплицирующуюся независимо от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации репликации, функционирующий в хозяйской клетке. Если же вектор предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК, то для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность, комплементарную определенному участку хромосомной ДНК хозяина (хромосомный сайт интеграции). Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Другими словами, эти векторы несут два типа сайтов инициации трансляции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционируют в Es heri hia oli, а другие — в эукариотических хозяйских клетках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих. [c.136]

Задержанно ранние гены включают в себя два гена репликации (необходимых для литической инфекции) и семь генов рекомбинации (некоторые из них отвечают за рекомбинацию при литической инфекции два гена необходимы для интеграции ДНК фага лямбда с бактериальной хромосомой при лизогенизации). Функции двух ге-нов-регуляторов, ll/ lll, необходимы для инициации синтеза лизогенного репрессора. Регуляторный ген Q кодирует фактор антитерминации, благодаря которому бактериальная РНК-полимераза получает возможность приступить к транскрипции поздних генов. Таким образом, задержанно ранние гены служат для двух целей одни из них необходимы для установления фагом лизогенного со- [c.208]

Модели с двухцепочечным и одноцепочечным разрывами предполагают некоторые различия в структуре молекулы, сочлененной в двух местах перед ее разрешением. Гетеро дуплексная ДНК образуется в каждом конце области, вовлекаемой в обмен. Между двумя гетероду-плексными сегментами находится область, соответствующая бреши, которая теперь содержит последовательность донорной ДНК в обеих молекулах. Таким образом, гетеродуплексные последовательности расположены асимметрично и часть одной молекулы превращена в последовательность другой (вот почему инициирующая хроматида названа реципиентом). Модель одноцепочечного разрыва предсказывает противоположный результат, при котором инициирующая хроматида вьшолняет роль донора генетической информации. Данные, полученные на клетках дрожжей, согласуются с моделью двухцепочечного разрыва инициация сопряжена с получением генетической информации. Эта модель предусматривает существование родства между сайтами, участвующими в событии генетического обмена, и подтверждается данными, полученными при анализе систем рекомбинации грибов. [c.446]

Такие сайты разделяют одну и ту же несимметричную последовательность из 8 пар оснований. В присутствии родственных последовательностей стимулирующий эффект утрачивается следовательно, любая замена основания в такой последовательности приводит к потере ею способности выступать в качестве горячей точки . Последовательность hi встречается обычно в ДНК Е. oli примерно один раз на каждые 10 тысяч пар оснований. Ее присутствие в ДНК фага лямбда дикого типа, а также в других генетических элементах свидетельствует, что она не существенна для Re A-зависимости рекомбинации. Последовательность hi способна стимулировать рекомбинацию в соседних областях, находящихся от нее на расстоянии до 10 тысяч пар оснований. Мы не знаем, какую именно роль она играет в рекомбинации, но возможно, что /ii-последовательность необходима для инициации или разрещения рекомбинационных интермедиатов. [c.452]

В фаговом геноме сайт POP и гены int и xis примыкают друг к другу, образуя своего рода обособленную функциональную единицу, ответственную за сайт-специфическую рекомбинацию. Транскрипция генов int и xis находится под контролем двух различных промоторов. Один из них расположен вне вышеупомянутой структурно-функциональной единицы, что обеспечивает согласование инициации рекомбинационных процессов с определенными этапами в жизненном цикле фага. На начальной стадии инфекции фагом X транскрипция гена int активируется регуляторным белком сП. При его участии РНК-полимераза может считывать int с промотора pj, локализованного внутри гена xis. Благодаря этому экспрессируется только ген int и образуется интеграза, обеспечивающая встраивание инфицирующего фага в сайт ВОВ на хромосоме клетки-хозяина (рис. 14.13). С другой стороны, когда в лизогенной [c.153]

Известно, также, что синтез стабильных РНК активируется взаимодействием регуляторной области гена с регу хяторными белками. Есть несколько подозреваемых активаторов и репрессоров, например, Fis-белок ( фактор инверсии стиму1яции ) (участвующий также в процессе рекомбинации вирусной ДНК) явно сильно стимулирует инициацию транскритщии, вероятно, за счет взаимодействия с UAS Вообще процесс регулирования очень сложен и пе до конца изучен, и я не буду здесь анализировать эти не устоявшиеся данные [c.23]

В. Эти результаты указывают на то, что гесВСО стимулирует гомологичную рекомбинацию в районе Хи-сайта, надрезая одну цепь, а затем выплавляя одноцепочечный ус . Эта одиночная цепь в присутствии гесА может быть использована для поиска гомологичной последовательности на другом дуплексе и тем самым для инициации образования межцепочечного обмена. [c.297]

Для вирусов гриппа описана также внутрисегментная (генная) рекомбинация [58], однако частота ее столь низка, что роль этого процесса в природной изменчивости минимальна. Тем не менее полученные данные указывают на то, что репликативный аппарат вируса гриппа способен в ряде случаев отсоединяться от матрицы, с которой он был связан. Очевидно, в этих случаях происходит преждевременная терминация на исходной матрице и комплекс репликативных белков (репликаза) возобновляет синтез на другой, гомологичной цепи (механизм смены матрицы). Такая преждевременная терминация приводит к появлению различного рода мутантов. Например, возобновление синтеза может произойти не точно в сайте терминации, а на несколько нуклеотидов дальше. При этом независимо от того, используется ли для возобновления репликации исходная цепь или гомологичная ей, образуются делеционные мутанты. Делеционные мутанты, сохраняющие концевые последовательности, служащие сигналами инициации синтеза РНК, часто образуются у вирусов с негативным РНК-геномом. Они называются дефектными интерферирующими частицами (ДИ-частицами) (гл. 7). Их дефектность обусловлена утратой генетической информации для синтеза необходимых белков, а способность интерферировать с полноценным вирусом объясняется высоким сродством к ферментативному аппарату репликации. Пока для вируса гриппа описаны ДИ-РНК, являющиеся производными сегментов РНК с 1-го по 3-й. Однако нет оснований считать, что другие сегменты устойчивы к накоплению делеций. Примером того, насколько резкие изменения может претерпевать репликативный комплекс вируса гриппа, служит рекомбинантная ДИ-РНК, описанная Филдсом и Уинтером [17]. Она содержит пять разных участков из третьего сегмента и, кроме того, область длиной 60 нуклеотидов из первого сегмента. Несмотря на измененную внутреннюю структуру, такая РНК поддерживается в популяции, поскольку содержит на обоих концах последовательности стандартного вируса. Недавно было показано [И]. что наиболее распространенные ДИ-РНК вирусов гриппа с одной внутренней делецией мо- [c.468]

Методом Ш-обмена получено несколько важных результатов. Например, установлено, что протоны, участвующие в образовании водородных связей двухцепочечной ДНК, обмениваются. Из данных по кинетике изотопного обмена и равновесному распределению изотопов и влиянию на них pH выяснено, что водородные связи в двухцепочечной ДНК постоянно разрушаются и образуются вновь этот процесс назвали дыханием и предположили-, что он лежит в основе возможного механизма таких процессов, как инициация синтеза ДНК и спаривание ДНК — ДНК при генетической рекомбинации. Второй пример — определение числа водородных связей в тРНК путем измерения доли быстро обмениваемых протонов эти данные были использованы для подтверждения одной из предложенных структур [c.522]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология