Хозяйская клетка III

Очень часто чужеродные белки, особенно небольшие, обнаруживаются в гетерологичных хозяйских клетках лишь в минимальных количествах. Такой кажущийся низкий уровень экспрессии кодирующих их генов во многих случаях объясняется деградацией чужеродных белков в хозяйских клетках. Один из способов решения этой проблемы состоит в ковалентном присоединении продукта клонированного гена к какому-нибудь стабильному белку клетки-хозяина. В составе подобной конструкции, получившей название химерный белок , продукт клонированного гена оказывается защищенным от расщепления протеазами хозяйской клетки, что было показано в ходе экспериментов. [c.112]

Применение химерных белков В некоторых случаях конечным продуктом, который предполагается использовать, является сам химерный белок. Например, нередко возникает необходимость в получении антител, узнающих конкретный участок белковой молекулы. Чтобы рещить эту задачу, можно встроить в подходящий вектор сегмент ДНК, кодирующий белковый домен, к которому будут вырабатываться нужные антитела. Образующийся в результате химерный белок и будет служить антигеном. Антитела к стабилизирующему его белковому компоненту, происходящему от хозяйской клетки, можно удалить абсорбцией их на чистом стабилизирующем белке, и тогда останутся только антитела, связывающиеся с нужной аминокислотной последовательностью. [c.113]

Обычно уровень генной экспрессии пропорционален числу копий транскрибируемого гена в хозяйских клетках. Отсюда следует, что с увели- [c.117]

Перенос полученной генетической конструкции хромосомный сайт интеграции/клонированный ген в хозяйскую клетку в составе плазмиды, не способной к автономной репликации в клетках этого хозяина. [c.123]

Перегрузка системы экспорта и нарушение правильной локализации жизненно важных белков хозяйской клетки вследствие перепроизводства чужеродного белка, экспортируемого из цитоплазмы к клеточной мембране или в периплазматическое пространство. [c.127]

Непосредственное влияние чужеродных белков на функционирование хозяйской клетки (например, превращение с их помощью важных незаменимых предшественников в неприемлемые, а иногда и токсичные соединения). [c.127]

В экспрессирующие векторы млекопитающих уже встроены гены самых разных белков и осуществлена их экспрессия в хозяйских клетках. Иногда выход продукта увеличивался, если между промотором и клонированным геном встраивали интрон. Механизм этого феномена неизвестен. Возможно, первичный транскрипт клонированного гена содержит скрытые сайты сплайсинга, по которым вырезается часть кодирующей области клонированного гена, а при наличии дополнительного интрона сплайсинг по ним происходит с меньщей вероятностью. [c.150]

Рекомбинантными плазмидами трансформируют клетки Е. соИ НЕ 101 и выращивают их в жидкой среде, а затем инфицируют бактериофагом X. Если в хозяйской клетке экспрессируется ген фермента рестрикции, то она оказывается устойчивой к литическому действию фагов типа X, ДНК которых активно расщепляется синтезируемой рестриктазой. [c.248]

Рис. 9-57. Метод выявления автономно реплицирующихся последовательностей (ARS-элементов) у дрожжей Эти последовательности выступают в роли точек начала репликации, содержащие их плазмиды способны самостоятельно реплицироваться в хозяйской клетке, не включаясь в состав хромосом.

Понятие клон определяе гея как большая популяция идентичных молекул, бактерий или клеток— потомков одного предка. Клонирование позволяет получать большое количество идентичных молекул ДНК, которые можно охарактеризовать и использовать в каких-то целях. Метод клонирования основан на том факте, что химерные или гибридные молекулы ДНК могут быть сконструированы в составе векторов для клонирования, к которым относятся бактериальные плазмиды, фаги или космиды, способные к репликации в хозяйских клетках под контролем своих собственных регуляторных элементов. Таким путем добиваются амплификации химерной ДНК. Общая схема процесса клонирования представлена на рис. 36.3. [c.40]

В связи с рассмотрением РНК фага MS2, следует указать также на другой способ размещения разных кодирующих последовательностей в одной мРНК. Дело в том, что MS2 РНК кодирует еще и четвертый белок, названный белком лизиса, или L-белком (он, повидимому, участвует в лизисе хозяйской клетки на завершающей фазе инфекции). Этот белок закодирован участком РНК, начинающимся в конце С-цистрона, захватывающим всю 36-нуклеотидную вставку между С-цистроном и S-цистроном и заканчивающимся в пределах S-цистрона рамка считывания этого перекрывающегося L-цистрона сдвинута вправо на один остаток (+1 сдвиг), так что никакие его участки не транслируются при синтезе С-белка и S-белка. L-цистрон имеет свой инициаторный кодон AUG, не в фазе с кодонами С-цистрона, и, соответственно, свой терминаторный кодон UAA, не в фазе с кодонами S-цистрона. Эта ситуация изображена на рис. 7. Использование перекрывающихся кодирующих последовательностей в пределах одной мРНК встречается, однако, не часто и свойственно, по-видимому, в основном вирусным системам, где экономия места для размещения цистронов играет особенно важную роль. [c.21]

Основная цель экспериментов по клонированию генов, которые предполагается использовать в биотехнологии, — подбор условий для эффективной экспрессии в нужном организме-хозяине. К сожалению, сам факт встраивания того или иного гена в клонирующий вектор еще не означает, что этот ген будет экспрессирован. В то же время, чтобы получение коммерческого продукта было экономически оправданным, уровень его синтеза должен быть достаточно высоким. Для достижения эффективной экспрессии уже сконструировано много специфических векторов для этого проводились манипуляции с целым радом генетических элементов, контролирующих процессы транскрипции и трансляции, стабильность белков, секрецию продуктов из хозяйской клетки и т. д. Среди молекулярно-биологических свойств систем экспрессии наиболее важны следующие 1) тип промотора и терминатора транскрипции 2) прочность связывания мРНК с рибосомой 3) число копий клонированного гена и его локализация (в плазмиде или в хромосоме хозяйской клетки) 4) конечная локализация синтезируемого продукта 5) эффективность трансляции в организме хозяина 6) стабильность продукта в хозяйской клетке. [c.105]

Эффективной трансляции может препятствовать и несовместимость клеток, обусловленная тем, что в клонируемом гене имеются кодоны, редко встречающиеся в геноме организма-хозяина. В таких случаях в хозяйской клетке может не доставать транспортных РНК (тРНК), узнающих редко используемые кодоны, что снижает выход продукта клонированного гена. Как рещить эту проблему - не совсем понятно. Если продукт клонированного гена очень ценен, можно попытаться химически синтезировать такой вариант клонируемого гена, который состоит из кодонов, обычно используемых хозяйским организмом (оптимизация кодонов). [c.121]

В. subtilis. На этапе 1 в хромосомную ДНК хозяйской клетки с помощью гомологичной рекомбинации встраивают маркерный ген. На этапе 2 маркерный ген замещают геном-мишенью. Аналогичную операцию повторяют для других сайтов. [c.125]

В. subtilis в составе плазмиды, включали в хромосомную ДНК с помощью рекомбинации, заменив им маркерный ген. Отбирали клетки, которые уже не экспрессировали маркерный ген, т. е. несли вместо него ген-мищень, интегрированный в хромосомную ДНК. Для интеграции других копий гена-мищени в хромосомную ДНК хозяйской клетки повторяли эту процедуру, используя другие несущественные области ДНК. [c.126]

Если слияние гена-мишени с фрагментом ДНК, кодирующим сигнальный пептид, не приводит к эффективной секреции белкового продукта, приходится использовать другие стратегические приемы. Один из таких приемов, с успехом примененных в отнощении интерлейкина-2, основывался на слиянии гена, кодирующего интерлейкин-2, с геном, кодирующим полноразмерный предшественник мальтозосвязывающего белка, а не только его сигнальную последовательность, и разделении этих генов сегментом ДНК, кодирующим сайт узнавания для фактора Х . Когда такой химерный ген включили в плазмидный вектор и использовали его для трансформации Е. соИ, в периплазме хозяйской клетки обнаружили в большом количестве химерный белок. Обработав его фактором Х , получили функциональный интерлейкин-2. [c.126]

Метаболическая перегрузка может привести к разнообразным изменениям в физиологии и функционировании хозяйской клетки. Одно из наиболее частых - снижение скорости роста клеток после введения чужеродной ДНК. Так, клетки, содержащие плазмиду, растут медленнее, чем нетрансформированные, не содержащие плазмид (табл. 6.6), что часто сопровождается утратой рекомбинантной плазмиды. Иногда метаболическая перегрузка приводит к тому, что под давлением отбора из плазмиды де-летируется рекомбинантный ген или его часть. [c.127]

Чтобы получить какой-то белковый продукт, необходимо обеспечить правильную транскрипцию кодирующего его гена и трансляцию соответствующей мРНК. Для инициации транскрипции в нужном сайте необходим промотор, а для ее остановки - терминирующий кодон. Клонированный ген часто бывает лишен таких сигнальных последовательностей, и для его экспрессии в прокариотической клетке-хозяине нужно обеспечить и то, и другое. Кроме того, поскольку для решения большинства биотехнологических задач белок должен образовываться в больших количествах, необходимо использовать промотор, который позволял бы получить высокий уровень транскрипции (сильный промотор) и распознавался РНК-полимеразой хозяйской клетки. Постоянная транскрипция клонированного гена истощает энергетические ресурсы хозяйской клетки, поэтому нужно использовать промоторы, работу которых можно регулировать либо с помощью специфических низкомолекулярных соединений, либо изменением температуры. [c.130]

Еще одна проблема - невысокая стабильность белков, кодируемых клонированными генами. Рекомбинантный белок может расщепляться про-теиназами хозяйской клетки. Чтобы избежать этого, можно изменить клонированный ген таким образом, чтобы на N-конце белковой молекулы оказались одна или несколько дополнительных аминокислот. В такой форме рекомбинантный белок уже не подвергается столь быстрой деградации. Кроме того, лишние аминокислоты иногда помогают в последующей очистке химерного белка, например с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке. При этом место соединения компонент подбирается так, чтобы по нему можно было расщепить молекулу (химическим или ферментативным путем) и получить эти компоненты в чистом виде. [c.130]

Из всех этих модификаций прокариотические хозяйские клетки наименее всего способны осуществлять правильное гликозилирование и модификацию специфических аминокислот в гетерологичном белке. Однако ни одна эукариотическая система не может осуществить одновременно все постгрансляционные изменения в каждом потенциальном гетерологичном белке. Таким образом, для получения белка с полным набором специфических модификаций необходимо провести тестирование различных эукариотических систем экспрессии и найти такую, которая воспроизводила бы биологически аутентичный продукт. [c.135]

Если вектор представляет собой плазмиду, реплицирующуюся независимо от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации репликации, функционирующий в хозяйской клетке. Если же вектор предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК, то для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность, комплементарную определенному участку хромосомной ДНК хозяина (хромосомный сайт интеграции). Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Другими словами, эти векторы несут два типа сайтов инициации трансляции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционируют в Es heri hia oli, а другие — в эукариотических хозяйских клетках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих. [c.136]

Для вьщеления специфических гетерологичных белков из клеточных экстрактов и из смесей секретируемых белков можно использовать разные подходы. Один из них основывается на присоединении к клонированному гену - без нарущения рамки считывания - сегмента ДНК, кодирующего короткую аминокислотную последовательность, которая специфически связывается с каким-либо химическим элементом, соединением или макромолекулой. Такую конструкцию встраивают в экспрессирующий вектор между промотором и сайтом терминации транскрипции. Короткая аминокислотная последовательность в составе рекомбинантного белка, синтезируемого в хозяйской клетке, играет роль аффинной метки. В одном случае перед клонированным геном был встроен - без нарущения рамки считывания - сегмент ДНК, кодирующий щесть остатков гистидина (Hisg), спейсерный участок, кодирующий семь аминокислот, и сайт [c.149]

Разработаны и другие схемы отбора с доминантным маркером, например с использованием фермента глутаминсинтетазы (GS), обеспечивающей устойчивость к цитотоксическому действию метионинсульфоксимина. В этой системе применяется вектор, несущий G -ген. Его вводят в культуру клеток млекопитающих и для отбора клеток, несущих больщое количество копий вектора, повышают концентрацию метионинсульфоксимина в среде. При этом в хозяйских клетках тоже должна присутствовать GS, поскольку только множественные копии ( 5 -гена могут обеспечивать устойчивость к метионинсульфоксимину. Такая схема обладает определенными преимуществами перед описанной выще. [c.150]

Для этого хозяйские клетки одновременно трансфицировали двумя экспрессирующими векторами млекопитающих, каждый из кото- [c.152]

Превращение триптофана в индол с помощью триптофаназы, которая синтезируется в хозяйских клетках Е. соИ. [c.254]

Для направленного изменения прокариот, синтезирующих определенные метаболиты, в принципе есть два пути. Во-первых, можно изменить активность или содержание одного или нескольких ферментов того или иного биосинтетического пути с тем, чтобы увеличить продукцию нужного метаболита. Во-вторых, в прокариотический геном можно ввести чужеродные гены, кодирующие ферменты, которые, используя эндогенный метаболит в качестве субстрата, обеспечат синтез метаболита, изнaчaJ Iьнo не продуцируемого хозяйской клеткой. Такого рода манипуляции представляются достаточно простыми, однако далеко не всегда [c.265]

В культурах с высокой плотностью может также возникнуть недостаток кислорода. Чтобы избежать этого, увеличивают количество пост ттающе-го воздуха (разбрызгивание) либо скорость перемешивания или делают и то, и другое. Кроме того, можно подавать в культуру чистый кислород, а не воздух, в котором содержится только 20% кислорода, или выращивать клетки под давлением, чтобы увеличить растворимость кислорода. В качестве альтернативы предлагалось экспрессировать в хозяйских клетках Е. соИ ген гемоглобина Vitreos illa, что значительно увеличило бы поглощение кислорода растущими клетками. [c.356]

Удельная активность белка AGpgal в течение 2 ч после начала индукции повышалась, а затем снижалась. Возможно, это было связано с синтезом протеаз клетками, перешедшими в фазу замедленного роста или в стационарную фазу. Кроме того, примерно 50% клеток, росших в течение 4 ч при 40 °С, утратили плазмиду. Но даже при этом после 4-часового культивирования при 40 °С на долю AGpgal-белка приходилось примерно 20% всей массы сухого вещества. Учитывая все это, можно не интегрировать гены белка AGPgal и репрессора l в хромосомную ДНК хозяйской клетки Е. соИ с целью увеличения выхода продуктов. [c.363]

Интеграция (Integration) Встраивание чужеродной ДНК (обычно с помощью гомологичной рекомбинации) в хромосому хозяйской клетки. [c.549]

При введении в протопласты нового генетического материала в виде чистой ДНК последняя не всегда сохраняется и экспрессируется в хозяйских клетках. Весьма перспективным представляется использование в качестве векторов Ti-плазмид Agroba terium tumefa iens (раздел 9.5.3), так как они непосредственно включаются в ДНК хозяина и легко экспрессируются при образовании опухолей. Ti-плазмиды, содержащие или не содержащие чужеродной ДНК, могут вызвать трансформацию протопластов растений. По-видимому, такие исследования будут проводиться все более интенсивно. [c.390]

Иными словами, напрасно мы считаем себя первоотрывателями универсальности генетического кода (Нобелевская премия 1968 г. по физиологии и медицине). Первыми это сделали задолго до нас предки вирусов, которые в дальнейшем научились порабощать хозяйские клетки. Таким же путем пошли многие эндопаразиты, использующие внутреннюю среду хозяина в качестве собственной среды обитания. Это, в частности, глисты (паразитические черви), отказавшиеся от кишечника и сохранившие лишь последнюю — внутриклеточную — стадию пищеварения. Но поскольку трудно найти другое столь же универсальное свойство живого, как генетический код (разве что выработка энергии в клетках молекулами АТФ), можно сказать, что ни одна группа паразитов не нашла столь обширного поля для применения своего открытия , как вирусы. Им доступны любые организмы, чем и обусловлено их повсеместное присутствие в биосфере. Более того, эволюция непрерывно увеличивает разнообразие потенциальных клеток-хозяев и, стало быть, разнообразие вирусов, которые могут в них паразитировать. [c.90]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология