Полинуклеотид-лигаза

В этом разделе рассматриваются основные ферменты биосинтеза нуклеиновых кислот, поскольку многие нз них широко используются в химико-ферментативном синтезе полинуклеотидов. Среди этих ферментов особый интерес представляют полимеразы и лигазы. [c.348]

ДНК-лигаза. Фермент, сшивающий полинуклеотиды, путем образования фосфодиэфирной связи между концевым остатком 5 -Р04 одного полинуклеотида и концевым остатком З -ОН другого полинуклеотида, в результате чего образуется единый полинуклеотид большего размера. [c.307]

Лигаза - фермент, образующий фосфодиэфирную связь между двумя полинуклеотидами. [c.62]

Оказалось, что дело обстоит иначе. В месте репликации двойная спираль ДНК слегка расплетается и обе цепи реплицируются небольшими фрагментами по 500—1000 мономерных единиц в длину (Оказаки, Су-гимото). Эти блоки образуются действительно путем встречного движения ферментов вдоль цепей. Но затем образовавшиеся блоки соединяются встык ковалентными (фосфоэфирными) связями. В итоге происходит как бы направленное продвижение точки репликации вдоль хромосомы. Стыкование блоков осуществляется с помощью специального фермента — полинуклеотид-лигазы. Этот фермент получен в чистом виде и хорошо изучен (Гурвиц, Вейс, Ричардсон). [c.197]

Хотя оба метода позволяют получать полинуклеотиды длиной до 100 нуклеотидов и более, с их помощью нельзя получить функциональные гены. Поэтому синтетические олиго- и полинуклеотиды, используемые для сборки гена, и в настоящее время сшивают способом, который на заре развития полинуклеотидно-го синтеза был предложен Г.Корана для соединения 20-мерных олигонуклеотидов, полученных фосфодиэфирным методом (рис. 83). Для соединения олигонуклеотидов I и II используется третий, вспомогательный, нуклеотид III, которых комплементарен 5 -концу одного и 3 -концу другого олигонуклеотида, образуя дуплекс с ником. Этот вспомогательный нуклеотид III играет роль матрицы для олигонуклеотидов I и II, причем его 3 -конец комплементарен 3 -концу олигонуклеотида II, а 5 -конец — 5 -концу олигонуклеотида I, несущего фосфомоноэфирную группу. Размер матрицы должен обеспечивать достаточную устойчивость дуплекса с ником, для чего каждый из сшиваемых олигонуклеотидов должен перекрывать матрицу III длиной по 8—10 пар нуклеотидов. Обработка комплекса олигонуклеотидов I, II и III ДНК-лигазой в присутствии доноров остатков АМР (АТР или NAD ) приводит к сшиванию олигонуклеотидов I и II. Как видно из рис. 83, двуцепочечный фрагмент образуется с выступающими одноцепочечными концами. Эти концы могут быть использованы для дальнейшего наращивания цепи. Для этого необходимо синтезировать олигонуклеотиды IV и V, частично перекрывающие выступающие 3 - и 5 -концевые фрагменты I — II нуклеотида. Обработка комплекса, содержащего олигонуклеотиды I — II, III, IV [c.298]

ДНК-лигазы — ферменты, катализирующие репарацию одноцепочечного разрыва, который обычно возникает под влиянием эндонуклеаз. Поэтому ДНК-лигазы называют еще исшивающими ферментами. Лигазы обнаружены в самых различных клетках, в том числе и в клетках, зараженных вирусами. Под влиянием этих ферментов образуются фосфодиэфирные связи между свободным 5 -фосфатным концом олнго- или полинуклеотида и З -гидроксильной группой соседнего олиго- или полинуклеотида. Скорее всего реакция протекает с обязательным образованием промежуточного комплекса лигазы с АМФ. Например, в клетках кишечной палочки такой комплекс образуется при взаимодействии лигазы с НАД, а в клетках млекопитающих такой комплекс образуется при взаимодейЛвии лигазы с АТФ. Предположительно схему действия ДНК-лигаз можно показать так (рис. 13) Катализируемые ДНК-лигазой ре- [c.51]

ДНК, комплементарного к цепи 50 первых нуклеотидов т-РНК аланина иллюстрируется на рис. 128. Синтезируются четыре цепи нуклеотидов изображенные в верхней части рисунка горизонтальными линиями. Каж дая из четырех цепей содержит по 20 нуклеотидов. Цепи построены так что верхняя правая линия соответствует 20 нуклеотидам ДНК, компле ментарньш к первым 20 нуклеотидам т-РНК аланина, верхняя левая линия соответствует двадцати следующим. Две нижние горизонтальные линии верхней части рисунка символизируют также отрезки ДНК по 20 нуклеотидов каждый, из них 20 - - 10 нуклеотидов комплементарны к соответствующим 30 нуклеотидам двух верхних цепей. В целом получается жестко связанная 30 парами комплементарных нуклеотидов система четырех цепей ДНК со свободными концами по 10 нуклеотидов в верхней и в нижней цепи. Имеются два разрыва фосфатных связей, отмеченные стрелками. Действием фермента лигазы эти разрывы зашиваются , и на их месте возникают фосфатные мосты. Таким образом, четыре первоначально взятых полинуклеотида превращаются в две цепи, в средней части комплементарно связанные друг с другом. Осталось с помощью полимеразы и набора свободных нуклеотидов комплементарно достроить оба свободных конца молекулы, и двойная спираль из 50 полинуклеотидов готова. Одна из ее цепей комплементарна к 50 первым нуклеотидам т-РНК, другая — комплементарна к первой. [c.695]

Вместо лигазы (ферментативный путь) в 1970 г. для зашивания разрывов в комплементарных полинуклеотидах предложен химический метод (М. А. Прокофьев, 3. А. Шабарова). Фосфатную группу в месте разрыва фосфатных связей синтетическим пyтeiM превращают в амидофосфатную, При сближении ее с концевым гидроксилом соседнего блока до расстояния ковалентной связи (что должно обеспечиваться компле-ментационными свойствами двух цепей) из-за образования водородной связи происходит взаимная активация групп в месте разрыва гидроксил приобретает свойства алкокси-иона, а атом фосфора становится более электрофильным (рис. 129 К —остаток аминокислоты). [c.697]

Точный механизм репликации двухцепочечной ДИК еще не изучен. Судя по пос.тедним данным, в процессе репликации образуются сравнительно короткие отрезки ДНК, которые затем сшргваются между собой с помощью фермента ДНК-лигазы. Этот фермент катализирует образование 3 —5 диэфирных связей между олиго- иди полинуклеотидами, удерживаемыми вместе комплементарной нитью [354, 355]. [c.231]

Фермент выделяют из клеток Е. oli, зараженных фагом Т4. С его помощью можно присоединять к З -ОН-концу РНК, но только в составе некоего 5, 3 -нуклеозиддифосфата. Присоединение идет, в отличие от ДНК-лигазы, на весу — без участия матрицы. Сфера использования фермента, вообще говоря, значительно шире он может пришить к З -ОН-концу РНК (или ДНК) любой полинуклеотид, имеющий фосфат на своем 5 -кон-це. Для введения метки на З -ОН-конец РНК в качестве донора радиоактивного фосфора чаще всего используют [5 - Ф]-фЦф. Этот нуклеозиддифосфат поставляется с УА до 3000 Ки/ммоль. Удельная ферментативная активность продажных препаратов Т4-РНК-лигазы составляет примерно 1000 ед./мг. 1 ед, фермента включает 1 ммоль устойчивого к действию фосфатазы Ф в поли(А) из [5 - Ф] олигорибоаденилата (в определенных условиях) за 30 мин при 37°. Хранить фермент следует растворенным в 0,02 М Трис-НС1 (pH 7,5) с 5 мМ р-меркаптоэтанола, [c.257]

Для получения рекомбинантной ДНК плазмиды выделяют из Е. соИ и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК (рис. 5.13). Для этого применяют рестриктазы. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в результате чего образуются липкие концы — неспаренные участки цепей, способные присоединять комплементарные им полинуклеотиды. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, тоже создают липкие концы, используя ту же рест-риктазу, и, следовательно, на фрагменте ДНК образуются липкие концы, комплементарные липким концам рестриктированной плазмиды. Если теперь смешать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединятся липкими концами (см. рис. 5.13). Затем с помощью фермента лигазы образуют фосфодиэфирнук) связь между концевыми нуклеотидами обеих молекул, и вновь получают кольцевую молекулу ДНК, но теперь она вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это и есть рекомбинантная ДНК, т. е. ДНК, содержащая новую комбинацию последовательностей (или генов), такую, какой прежде в природе не было. [c.173]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология