Выделение свободных нуклеотидов

Рис. 5-2. Реакция элонгации, катализируемая ферментом РНК-нолимеразой. На каждом этане из поступающих рибонуклеозидтрифосфатов отбирается один, способный к комплементарному спариванию с открытой матричной цепью ДНК, в результате к растущему З -ОН-концу цепи РНК добавляется рибонуклеозидмонофосфат (цветная стрелка), а пирофосфат (выделен цветом) высвобождается. Таким образом новая цепь РНК растет в направлении 5 3 и оказывается комплементарной матричной цепи ДНК. Движущей силой реакции является термодинамически выгодное изменение свободной энергии, сопровождающее высвобождение пирофосфата, и гидролиз пирофосфата до неорганического фосфата. Перемещающаяся вдоль спирали ДНК РНК-полимераза непрерывно раскручивает спираль впереди той точки, где происходит полимеризация, и вновь закручивает ее позади этой точки, высвобождая новосинтезированную цепь РНК. Поэтому небольшой участок РНК-ДНК-спирали (для бактериального фермента - около 17 пар нуклеотидов) существует лишь короткое время. Готовый РНК-продукт высвобождается в виде одно-цепочечной копии одной из двух цепей ДНК.

Выделение свободных нуклеотидов [c.47]

Настоящая книга, издаваемая в серии научных трудов ВИР, освещает методы и методики по определению содержания нуклеиновых кислот в растительных тканях и препаратах. В ней также изложены — идентификация и количественный учет свободных нуклеотидов выделение нативных РНК и ДНК из растений фракционирование их на колонках определение нуклеотидного состава РНК и ДНК методами колоночной и бумажной хроматографии изучение свойств макромолекул нуклеиновых кислот, обнаружение их в клетке, цитофотометрия, определение состояния ДНК и РНК в клетке. [c.2]

Выделение, идентификация и количественный учет свободных нуклеотидов [c.46]

Метод основан на выделении свободных нуклеотидов из экстракта активированным углем с последующим разделением их на колонке с анионообменником ДАУЗКС-1. [c.46]

При облучении водных растворов оснований нуклеиновых кислот видимым светом в присутствии ионов двух- и трехвалентного железа в нейтральной или слабокислой среде гетероциклические основания полностью или частично расщепляются, о чем свидетельствуют изменения УФ-сиектров растворов. Пиримидины расщепляются при этом быстрее пуринов В аналогичных условиях нуклеозиды и нуклеотиды наряду с частичной деградацией составляющих оснований претерпевают расщепление N-гликозидной связи с выделением свободного основания. При облучении полинуклеотидов наблюдаются те же процессы, сопровождающиеся, кроме того, частичным гидролизом фосфодиэфирных связей и потерей биологической активности [c.685]

Нуклеиновые кислоты соложеного ячменя растворяются и гидролизуются, превращаясь в нуклеотиды, которые, в свою очередь, преобразуются в пуриновые и пиримидиновые нуклеозиды, а затем — в свободные основания и сахара. Данный процесс способствует также выделению фосфора, необходимого для формирования биомассы дрожжей. [c.34]

Этап поиска и клонирования генов (их выделение и сборка в одну конструкцию) уже отлажен. Гены, кодирующие белки, состоят, как правило, из трех основных участков промотора (определяющего экспрессию данного гена, с чего начинается транскрипция) кодирующей части (где содержится информация о структуре белка — продукта этого гена) и поли-А-области (цепочки адениновых нуклеотидов, ответственной за окончание транскрипции). В генной инженерии из частей разных генов получают рекомбинантные (химерные) гены. Например, кодирующий участок в таком гене может быть позаимствован у любого организма. Возможность свободно обращаться с генетическим материалом — основное преимущество молекулярной селекции перед традиционной, где перенос генов происходит лишь между близкородственными видами. Кроме того, используя подходящие промоторы, можно добиться, чтобы экспрессия гена происходила в нужных органах или тканях (корнях, клубнях, листьях, зернах) и в нужное время (скажем, при дневном освещении). [c.101]

В свободном СОСТОЯНИИ из нуклеотидов )-рибозы встречаются только 5 -фосфаты. Например, из мышечной ткани животных выделен аденозин-5 -фосфат [c.364]

Для выделения свободных нуклеотидов берут навеску свежего растительного материала (6—10 г) и сразу растирают в жидком азоте, затем в ступке с песком 1в 9 жл 1 н. НСЮ4 при 0°. Гомогенат центрифугируют в течение 10 минут при 4000 на [c.47]

Нуклеотиды являются низкомолекулярными фосфатами Ы-глюкозидов пуриновых и пиримидиновых оснований и обладают свойствами кислот. Эти свойства нуклеотидов в основном обусловливают методы их выделения, очистки и идентификации. Ниже приводится схема изучения свободных нуклеотидов, составленная на основе работ Берквиста [7] — [9], Шебеста и Шорма [13], [14] и апробированная нашей лабораторией. [c.46]

Значительную ценность представляют собой рибонуклеазы высокой специфичности, так как они не только расщепляют нуклеиновую кислоту на олигонуклеотиды, которые во многих случаях можно разделить и определить их структуру, но и указывают также в общем распределение нуклеотидов. Так, обнаружено, что пропорция пиримидиновых нуклеозид-З -фосфатов (по отношению к общему содержанию пиримидинов в нуклеиновой кислоте), выде ляющихся под действием панкреатической рибонуклеазы, в значительной степени варьирует. Нри известной специфичности фермента высокий процент выделения свободных пиримидиновых нуклеотидов по отношению к общему содержанию пиримидинов указывает на наличие участков цепи, в которых два или более пиримидинов следуют подряд друг за другом, в то время как выделение мононуклеотидов в относительно малом количестве указывает на то, что пиримидиновые нуклеотиды в основном соединены (через 5 -гидро-ксильную группу) с З -фосфатами пуриновых нуклеотидных звеньев. В этой связи представляет интерес факт, что из растворимых в солевом растворе дрожжевых нуклеиновых кислот выделяется около 50% цитидиловой, уридиловой и псевдоуридиловой кислот в расчете на общее содержание каждой из них и только 10—20% тиминовых нуклеотидов [161]. Из рибонуклеиновой кислоты вируса табачной мозаики штамма М после исчерпывающего переваривания панкреатической рибонуклеазой выделено значительно большее количество пиримидиновых нуклеотидов, чем в случае штаммов ТМУ, НК и УА следовательно, распределение пиримидиновых нуклеотидов в РНК из штамма М отличается от распределения нуклеотидов в РНК штаммов ТМУ, НР или УА [162] (ср. с приведенными ниже данными). [c.392]

Лабильность связи нуклеозид—фосфор в исследованных структурах свидетельствует о том, что эта связь, устойчивая в свободных нуклеотидах, молсет расщепляться в некоторых их производных. По-видимому, это необходимо учитывать при анализе нуклеотидного материала, выделенного из биологических объектов, поскольку весьма возможно существование в них нуклеотидов в связанной форме. Поэтому очень интересные результаты были получены прн выделении из кислотнорастворимой фракции нуклеотидов, среди которых в значительных количествах были оф1аружены уридин и аденозин [43]. Скорее всего соответствующие нуклеотиды находились в клетке в связанной форме и даже при очень мягкой обработке расщеплялись до нуклеозидов. [c.369]

Согласно литературным данным, продукты распада РНК, в частности пиримидиновые основания, не подвергаются реутилизации (Hurlbert, Potter, 1952). В сердечной мышце уровень радиоактивности РНК в 10—15 раз превышает С-активность фонда кислоторастворимых свободных нуклеотидов в расчете на единицу массы ткани. Это позволяет думать, что продукты распада РНК существенно не подвергаются реутилизации в процессе синтеза РНК. Ход изменения радиоактивности гидролизата РНК в наших опытах совпадал с ходом изменения радиоактивности выделенного из гидролизата уридилово-го нуклеотида следовательно, выход метки из всех продуктов гидролизата РНК и из уридилового нуклеотида протекал одинаково. [c.324]

Рестрикция (разрезание) выделенной из клеток ДНК осуществляется ферментами — рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). Эти ферменты вступают в реакцию с определенными участками ДНК, так называемыми сайтами узнавания, которые в клетке обычно бывают защищены специальными группировками (метилированы). После обработки ДНК эндонуклеазами фрагменты имеют так называемые липкие концы рестрик-тазы разрезают две цепи ДНК не в одном месте, а в двух разных местах, в результате чего одна из цепей оказывается длиннее другой на несколько нуклеотидов. Свободные нуклеотиды мо1ут спариваться с комплементарны.ми нуклеотидами другого фрагмента ДНК с липкими концами. Благодаря этому, ДНК из различных источников может объединяться, образуя рекомбинантные молекулы. Это свойство рестрикционных фрагментов ДНК ис-нoль yeт( я в генной инженерии для со 1дания искусственных векторов на основе бактериальных плазмид, или фагов. [c.67]

Известно, что расщепление фосфо-эфирной связи идет через промежуточное состояние, в котором пять ковалентных связей атома Р находятся в тригональной бипирамидальной кон фигурации. Поэтому реакцию присоединения нуклеотида можно представить двухстадийной схемой (рис. 9.7). Образование промежуточной системы II требует энергии напротив, выделение пирофосфата освобождает свободную энергию. Модель исходит из представления о перекрывании обеих стадий. Предполагается, что при раскручивании ДНК и возникновении гибридной двойной спирали ДНК — РНК матрица ДНК функционирует в А-, а не в обычной -форме, т. е. Л-форма стабилизуется в участке матрицы, примыкающем к активному центру системы. Это положение аргументировано рядом фактов [42]. Локальный переход В-формы в Л-форму во время действия полимеразы может индуцироваться удалением молекул воды из участка ДНК, связанного с ферментом, что благоприятствует поликонденсации нуклеотидов. Как показывает изучение молекулярных моделей, не г стерических препятствий для выхода основания в одной цепи ДНК из гликозидной выемки в Л-форме ДНК после разрыва водородных связей с основанием комплементарной цепи. При этом конформация второй цепи не меняется. [c.567]

Состояние компетентности определяется способностью бактериальной клетки включать ДНК из окружающей среды. Это было продемонстрировано в эксперименте с использованием трансформирующей ДНК, меченной Р (в фосфодиэфирных мостиках, связывающих последовательные нуклеотиды), выделенной из 51г -пневмококков, которые были выращены в среде, содержащей Р. Насыщающие количества такой меченной Р ДНК добавляли к несинхронизированной немеченой 51г -куль-туре реципиента. После довольно продолжительного контакта с донорной ДНК клетки реципиента осаждали центрифугированием и отделяли от свободной ДНК. Затем определяли количество связанной Р-метки в осадке и подсчитывали число возникающих 81г -трансформантов. Этот эксперимент был выполнен еще в двух вариантах. В первом использовали меченную по Р донорную 51г -ДНК, к которой добавляли 10-кратный избыток немеченой 3 г -ДНК, во втором использовали реципиентные Str -бaктepии из синхронизированных культур, находящихся в максимальной и минимальной стадиях компетентности. Результаты трех экспериментов можно суммировать следующим образом количество меченной Р ДНК, приходящееся на одну реципиентную клетку в культуре при использовании чистой меченной донорной ДНК, было выше, чем в случае использования донорной ДНК, смешанной с немеченой 51г -ДНК. Кроме того, это количество было выше в случае использования синхронизированной реципиентной культуры в фазе максимальной компетентности, чем при использовании несинхронизированной культуры, причем включение в несинхронизированную культуру в свою очередь [c.166]

Воздействие длинноволнового УФ-света в интервале длин волн 320—390 нм = 365 нм) в течение 30 мин приводит к полному ингибированию ферментативной активности На" , К+-АТФазы. Хромофорами УФ-света в этом диапазоне длин волн являются различные (восстановленные) пиридиннуклеотиды, флавины, железопорфирины. Таким образом, инактивация мембраносвязанного фермента в данном случае может быть обусловлена фотохимическими превращениями вышеназванных хромофоров. Не исключена вероятность локализации этих акцепторов УФ-излучения на мембране в непосредственной близости к исследуемому белку. Вместе с тем, учитывая то обстоятельство, что хромофорные группы мембран (порфирины, флавины, нуклеотиды) выступают в качестве сенсибилизаторов пероксидного окисления липидов, можно предположить, что в процесс модификации На , К -АТФазы вносят вклад преимущественно вышеуказанные компоненты эритроцитарных мембран, а также фотосенсибилизированное ими пероксидное окисление липидов. При УФ-облучении выделенных микросом мозга крыс обнаруживается корреляция между снижением активности На , К+-АТФазы и пероксидным окислением липидов, оцениваемым по содержанию полиненасыщенных жирных кислот и накоплению малонового диаяьдегида (J. Jamme et а1., 1995). Подавление активности Ка , К+-АТФазы при облучении микросом УФ-светом снижалось тушителем свободных радикалов — тиомочевиной и не изменялось в присутствии защитника тиолов — дитиотреитола. Авторы считают, что эффект ПОЛ опосредуется нарушением целостности мембран, а не структурными изменениями самого фермента. [c.170]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология