Полинуклеотиды и большие олигонуклеотиды

IV. Полинуклеотиды и большие олигонуклеотиды [c.89]

Несмотря на применение защищенных производных нуклеотидов и нуклеозидов, некоторые побочные реакции (например, образование пирофосфатов при синтезе исходя из моноэфиров фосфорной кислоты) все же имеют место вследствие этого требуется тщательная хроматографическая очистка продуктов реакции. Одним из приемов, позволяющих существенно упростить очистку продуктов реакции, является фиксация одного из компонентов реакционной смеси на полимерном носителе Такой полимер может быть легко отделен от других компонентов реакционной смеси. Продукт реакции, фиксированный на полимере, можно подвергать дальнейшим превращениям, что значительно упрощает многостадийные синтезы. Наконец, после выполнения всех стадий продукт может быть отщеплен от полимера и выделен в чистом состоянии. Такой подход к синтезу олигонуклеотидов привлекает сейчас большое внимание . Неспецифичность химических методов создания межнуклеотидной связи, являющаяся недостатком химического подхода к синтезу олигонуклеотидов (получение защищенных производных нуклеозидов и нуклеотидов требует многостадийных синтезов), в данном случае дает ряд преимуществ, поскольку в синтез олигонуклеотидов могут быть введены самые разнообразные производные нуклеозидов, в том числе и синтетические аналоги компонентов нуклеиновых кислот. Это открывает широкие возможности исследования связи структуры и функции природных полинуклеотидов. [c.86]

Влияние синтетических олигонуклеотидов (со средней длиной цепи около б нуклеотидов) на спектры поглощения розанилина, толуидинового голубого и акридинового оранжевого (рис. 8-3 и 8-4) [21, 22] было сходным, но не идентичным тому, которое наблюдалось при использовании нуклеиновых кислот. Чтобы избежать связывания с отдельными мономерными фрагментами, которое, по-видимому, могло произойти при большом избытке полимера, использовали эквимолярные количества красителя и полинуклеотида [56[. Кроме того, применяли буферные растворы с низкой ионной силой, так как при избытке катионов, особенно двухвалентных, константы связывания для комплексов краситель — нуклеиновая кислота понижены. (Двухвалентные катионы примерно в 30 раз эффективнее одновалентных и, по-видимому, действуют исключительно как [c.529]

В литературе описаны попытки использования сефадексов и биогелей, представляющих собой соответственно сшитый декстран и гранулированный полиакриламидный гель, для разделения компонентов нуклеиновых кислот за счет различного сродства их молекул к сорбенту [32, 33]. Однако в основном гель-хроматографию применяют для фракционирования нуклеиновых кислот и их компонентов в соответствии с размерами молекул этих соединений. Например, на колонке с сефадексом 0-10 нуклеозиды и нуклеотиды отделяются от неорганических солей (выходят со свободным объемом колонки) [34]. Аналогичным образом олигонуклеотиды, содержащие больше 10—15 нуклеотидных остатков, не задерживаются на сефадексе 0-25 или 0-50, а мононуклеотиды проникают в поры геля и поэтому элюируются значительно медленнее [3]. Именно этот метод широко используют для удаления избытка нуклеозидтрифосфатов из смеси биосинтетических олиго- и полинуклеотидов [35]. [c.167]

Вопросы разработки методов синтеза олиго- и полинуклеотидов в последнее время привлекают большое внимание исследователей. Это связано с тем, что синтетические олигонуклеотиды стали использоваться для идентификации фрагментов природных нуклеиновых кислот, изучения их химических свойств, а также как инструмент исследования в молекулярной биологии и молекулярной генетике (для расшифровки генетического кода, функционирования генома, процессов взаимодействий нуклеиновых кислот с белками, в том числе ферментами нуклеинового обмена, антибиотиками и т. д.). [c.280]

Вследствие более значительного перекрывания полинуклеотидов, чем олигонуклеотидов, лигазные комплексы обладают большей стабильностью, что в ряде случаев позволяет получать целевые гены одностадийной ферментативной реакцией. Так, гены пептида III, активирующего рост соединительной ткани (85 АК), и уби-квитина (76 АК) были получены одностадийным лигированием 20 полинуклеотидов длиной от 28 до 32 нуклеотидных звеньев и 8 полинуклеотидов длиной от 50 до 64 нуклеотидных звеньев соответственно. В первом случае успех был обусловлен, кроме всего прочего, применением специальной программы Repeat для поиска непро-д тстивных комплексов. Путем вариации кодонов в последовательности гена пептида III было предотвращено образование неправильных комплексов, в которых возможно взаимодействие 8 и более пар оснований. [c.69]

Разработаны методы синтеза полинуклеотидов — простейших моделей нуклеиновых кислот. Эти методы послужили основой для синтеза олигонуклеотидов с заданной последовательностью нуклеотидов. Использование химических и биохимических методов синтеза дали возможность Каране получить полинуклеотид, соответствуюший активному фрагменту дезоксирибонуклеиновой кислоты. Все эти достижения в области исследования строения, функций и синтеза биополимеров позволили на другом, новом—молекулярном уровне подойти к изучению жизненных процессов. Есть все основания предполагать, что в ближайшее время нас ждут большие и интересные открытия в мире познания самых сложных и тонких областей жизнедеятельности организма (деятельности нервной системы, межклеточного взаимодействия, явлений иммунитета и т. д.). [c.54]

В настоящее время методы синтеза олиго-. и полинуклеотидов разработаны в такой степени, что в короткие сроки могут быть получены искусственные фрагменты ДНК большой длины и практически любого состава. Достигнут существенный прогресс и в синтезе полирнбонуклеотидов. Общая стратегия синтеза полинуклеотидов и нуклеиновых кислот заключается в комбинированном использовании химических и ферментативных методов. Относительно небольшие олигонуклеотиды синтезируют химически, а затем соединяют в длинные цепн с помощью соответствующих ферментов. [c.348]

Дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы [2, 52] расш епляет высокомолекулярные дезоксирибонуклеиновые кислоты до олигонуклеотидов и незначительно до мононуклеотидов, большая часть скелета полинуклеотида остается без изменения. Рибонуклеиновые кислоты при действии дезоксирибонуклеазы остаются без изменения. Кристаллическая дезоксирибонуклеаза I имеется в продаже. [c.442]

Нуклеиновые кислоты представляют собой полимерные соединения, которые различными способами могут быть расщеплены на люнонуклеотиды. Для удобства полимеры мононуклеотидов будут называться олигонуклеотидами, когда число мономерных единиц в молекуле составляет от 2 до 7 (приблизительно), и полинуклеотидами, когда это число превышает 7 . Как и в случае многих макромолекул, понятие дюлекула становится довольно неопределенным при очень больших молекулярных весах вследствие процессов агрегации и дезагрегации, которые могут происходить с большей или меньшей легкостью. И снова для удобства молекулами следует называть только структуры, образованные целиком ковалентными связями макромолекула — это очень большая одиночная молекула (которая, кроме ковалентных связей, может содержать вторичные внутримолекулярные связи) агрегаты должны быть описаны отдельно и люгут быть определены, когда это известно, как ди-, три- или полимолекулярные, указывая число молекул или тяжей, образующих комплекс. [c.363]

Полное разрущение нативной ДНК до нуклеозидов или мононуклеотидов может приводить к увеличению оптического поглощения при 260 м 1 на 60—70%. В меньщей степени уменьшение оптического поглощения по сравнению с мономерными компонентами характерно для всех полинуклеотидов (включая апуриновые и апиримидиновые кислоты [369]) и олигонуклеотидов. В различные периоды гиперхромный эффект, проявляющийся при разрушении полинуклеотидов, приписывали главным образом остаткам гуаниловой кислоты [370], гуаниновым и цитидиновым остаткам [371[ и полипуриновым фрагментам [372[. Разрушение упорядоченной образованной водородными связями структуры сопровождается большим гиперхромным эффектом, но даже после полной денатурации остаточный гиперхромизм составляет 10—20%. Этот эффект соответствует гипохромизму олигонуклеотидов, на который мало влияют ионная сила или температура и для которого не характерны необратимые изменения при обычных условиях денатурации. Как было показано при изучении синтетических олигонуклеотидов, этот остаточный гипохромизм не связан с образованием водородных связей (см. стр. 496). [c.631]

Известно несколько ферментов, катализирующих последовательное отщепление нуклеотидов от нуклеиновых кислот, начиная с определенного конца. Такие ферменты широко используются при определении последовательности олигонуклеотидов. Кроме того, ферменты эти можно с успехом использовать в тех случаях, когда необходимо осуществить полное расщепление РНК либо на З -нуклеотиды, либо на 5 -фосфорилированные нуклеозиды. Ферментом, атакующим нуклеиновые кислоты с 5 -конца, является экзонуклеаза селезенки, тогда как фосфодиэстераза змеиного яда и полинуклеотидфосфори-лаза атакуют полинуклеотид с З -конца, образуя фХ и ффХ соответственно. Однако все попытки использовать такие ферменты для определения последовательности у столь больших нуклеиновых кислот, как вирусные РНК (подобно тому как аминопептидазы и карбоксипептидазы были использованы для анализа белков), оказались обескураживающими. Следует отметить также, что эти экзо-нуклеазы наиболее активны в отношении немодифициро-ванных и незамещенных концевых групп. Так, экзонуклеаза селезенки не атакует 5 -фосфорилированные концы, [c.101]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология