Селекция устойчивых клонов

Ответ, по-видимому, будет пе обязательно , и хорошим примером служит картофель. Сорта, выращиваемые в Северной Америке и Европе, произошли от небольшого образца тетраплоидных южноамериканских клонов, дополненных нечастым введением нового материала. В 1940-х годах фитофтороз еще больше уменьшил изменчивость в немногих выживших клонах. Селекция, проводившаяся с того времени, заключалась главным образом во введении доминантных генов устойчивости к болезни, и до самого последнего времени не было ни од-но1 о серьезного введения изменчивости [34]. Хотя селекционеры ежегодно выращивают миллионы сеянцев, очень немногие из них остаются для замены ведущих сортов, многим из которых более 30 лет. Здесь безусловно будет оправдан совершенно новый подход к селекции новых сортов, начав ее с самого начала. Успех новых высокоурожайных сортов риса и пшеницы показывает, что пример высокой урожайности быстро создает спрос на принципиально, новые сорта. Ряд селекционеров картофеля в США и в других странах подошли к этой проблеме, ведя отбор на увеличенный размер клубней и полевую устойчивость к фитофторозу в популяциях дикорастущего материала, зародышевая плазма которого почти не была затронута обычными селекционными программами [35]. Несмотря на то, что никаких новых сортов не было передано в производство или на испытание, эта идея ценна, если главной целью ставится введение генетической изменчивости. [c.270]

Оба обсуждаемых метода часто используются комбинировано, т. е. для обогащения клонотеки генами метилазы используют биохимический метод селекции, а на следующем этапе отбирают клоны, устойчивые к фагу [22, 139, 200]. [c.187]

Первичный отбор гибридных клонов значительно упрощается, если в векторной молекуле предусмотрена специальная фенотипическая система селекции. При трансформации клеток чаще всего используют векторные молекулы ДНК, несущие гены устойчивости к антибиотикам и антиметаболитам. Поэтому на среде с определенным антибиотиком или антиметаболитом будут расти только клетки трансформантов. Особенно хорошо данная система селекции отработана для бактерий, так как получены векторные плазмиды, детерминирующие устойчивость трансформированных клеток сразу к нескольким антибиотикам. Если векторная плазмида определяет устойчивость к двум антибиотикам и при встройке в нее экзогенного фрагмента ДНК нарушается одна из генетических детерминант устойчивости к антибиотикам, то клоны клеток, содержащих такие гибридные ДНК, легко отличить от трансформантов, включающих исходный вектор, на средах с каждым антибиотиком в отдельности. [c.34]

Рассмотренные плазмиды — векторы с негативной селекцией, так как гибридные молекулы ДНК выявляются по инактивации определенных генов устойчивости к антибиотикам. Первоначально на агаризованной селективной среде с определенным антибиотиком отбирают клоны клеток, содержащих или гибридные, или исходную плазмиды, а лишь затем перепечаткой на среду с антибиотиком, ген устойчивости к которому в гибридных плазмидах должен быть нарушен, выявляют клоны гибридов. [c.243]

Кроме целевого гена в геном гибридного ретровируса встраивают селективный маркер преимущественно доминантного типа. Это намного упрощает отбор клонов клеток, содержащих интегрированную ДНК гибридных ретро-вирусов. Наиболее часто таким маркером служит ген пео, так как селекция в данном случае (устойчивость к антибиотику G-418) проста [c.406]

В ряде случаев возникает необходимость удаления маркерного гена, по которому осуществлялась селекция трансгенных растений, из генома полученных клонов. Это важно при последовательном введении в растение разных чужеродных генов и связано с тем, что число эффективных селективных маркеров ограничено. Кроме того, это может требоваться при масштабном выращивании трансгенных растений для предотвращения распространения генов устойчивости к антибиотикам в окружающей среде. [c.485]

Для клонирования пео-содержащих провирусов предложены две упрощенные методики каждая из них предполагает селекцию искомого клона в клетках . oli на устойчивость к канами-цину. Одна из методик представляет собой модифицированную процедуру спасения маркера и предусматривает прямое клонирование провируса в плазмидном векторе. Другая методика, гораздо более эффективная, требует применения специальных ретровирусных челночных векторов, описанных в разд. 9.3.2.4. [c.300]

Селекция котрансформантов с онкогенными последовательностями и геном устойчивости к микофеноловой кислоте. После обработки клеток плазмидной ДНК в составе кальцийфосфатного преципитата клетки культивируют в течение 3 сут на среде Дальбекко с 5 % эмбриональной сыворотки коров. После инкубации клетки снимают смесью трипсина с версеном (I 1) и рассевают по 10 клеток на 60 мм чашки на селективную среду, содержащую 25 мкг/мл микофеноловой кислоты, 2 мкг/мл аминоптерина, 250 мкг/мл ксантина, 15 мкг/мл гипоксантина и 10 мкг/мл тимидина (подробно о приготовлении среды ГАТ и микофеноловой кислоты см. ст. О. Л. Глебова, наст. сб.). Селективная среда также готовится на среде Дальбекко с 10,-% эмбриональной сыворотки коров. Кормление клеток свежей средой с селективными агентами проводится каждые 4 сут. Устойчивые клоны можно видеть через 7—10 сут, а выделение их с помощью титановых цилиндров проводится через 14 сут на селективную среду. Клоны размножают, выделяют ДНК и гибридизацией [c.228]

Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя плазмиду pBR322 (см. рис. 5.10), содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бактерий в агар добавляют антибиотик — или ампициллин, или тетрациклин в зависимости от того, какой из генов (Ыа или tet) остался интактным после введения чужеродной ДНК. На такой среде клоны образуют клетки только с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона переносят на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген устойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этих чашках Петри дают клоны только те бактерии, которые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Такая тщательная селекция клонов по устойчивости к антибиотику позволяет идентифицировать рекомбинантные клоны. При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод авторадиографии. [c.121]

Для отбора клеток, устойчивых к неблагоприятным или стрессовым факторам, наиболее часто применяют прямую селекцию. После выбора нужной популяции необходимо проверить стабильность устойчивости к неблагопрргятному фактору. Это длительный процесс, включающий многочисленные циклы выращивания и пересадки клеток на среды, содержащие селективный фактор или без него. Из стабильных клонов необходимо попытаться регенерировать растения. Получение растений-регенерантов, а также гибридологический анализ подтверждают генетическую природу при- [c.187]

Получение стабильно устойчивых линий — процесс длительный. Как правило, селекция начинается с получения достаточного количества каллусной массы из изолированных растительных эксплантов, использующейся в дальнейшем для определения концентрации селективного фактора (построение дозовой кривой), при которой наблюдается одновременно рост каллусной ткани, и в то же время часть каллусных колоний погибает. Выбранная концентрация селективного фактора признается оптимальной и используется в дальнейших экспериментах. Так как первично полученные на средах с селективными факторами колонии клеток могли возникнуть вследствие физиологической адаптации или определенного состояния дифференцировки клеток и не быть генетически устойчивыми, то в течение последующих А—6 субкультивирований на селективной среде проверяется стабильность устойчивости полученных клонов. Затем их переносят на среду без селективного фактора и субкультивируют еще 2—3 пассажа. И только после повторного возвращения в селективные условия отбирают стабильные клоны, из которых пытаются получить рас-тения-регенеранты. Однако работы, проведенные с получением растений, устойчивых к повышенным солям, а также к токсинам, выделенным из грибов — возбудителей болезней, показали, что устойчивость клетки и растения к исследуемому селективному фактору может совпадать и не совпадать. Прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для низких температур, устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям алюминия и другим факторам. [c.143]

Принцип метода схематически показан на рис. 3.2. Космидные библиотеки, сконструированные в гесЛ -клетке, упаковывают в Я-частицы, чтобы получить лизат с высоким титром трансдуцирующих частиц. Аликвоты упакованной библиотеки используют затем для заражения гес+-клеток, в которые предварительно введена последовательность (или последовательности) -зонд, клонированная в плазмиде, не имеющей гомологии с космидным вектором. Через 30 мин — 2 ч, в течение которых должна произойти рекомбинация, космиды вновь упаковывают в фаговые частицы. Упакованные космиды используют для заражения гесЛ -хозяина, проводя селекцию по обоим маркерам лекарственной устойчивости — плазмидному и космидному. Поскольку плазмида не несет os-последовательностей, она будет перенесена в реципиентные клетки только в случае рекомбинации с гомологичной последовательностью в космидном клоне. Для того чтобы восстановить исходную космиду, можно вновь разделить два клопа в результате второго рекомбинационного события и после переноса в нового хозяина идентифицировать ревертантов на индикаторных чашках. Как будет сказано ниже, точное восстановление, однако, не всегда возможно (или желательно). [c.78]

Потеря онкогенных свойств означает, что в этом случае трансформированные ткани невозможно идентифицировать как неопластические выросты, клетки которых легко селектировать по их способности к росту на среде, не содержащей фитогормонов. Для разрешения проблемы идентификации трансформированных клеток между повторами длиной 25 п. н. встраивают бактериальные гены устойчивости к антибиотикам, помещенные под контроль промоторов Т-ДНК и снабженные сигналами полиадени-лирования. Такие химерные гены устойчивости к антибиотикам эффективно экспрессируются в растительных клетках как доминантные признаки в любом генетическом окружении. Удобно, чтобы маркерные гены были тесно сцеплены с чужеродной ДНК по двум причинам. Во-первых, это позволяет осуществлять прямую селекцию трансформированной ткани растения, чтобы убедиться в переносе чужеродной ДНК. И во-вторых, это гарантирует, что фланкирующая чужеродная ДНК в конкретном трансформированном клоне, полученном в результате селекции, не была встроена в нетранскрибируемую область генома. [c.18]

Смотреть страницы где упоминается термин Селекция устойчивых клонов: [c.107] [c.107] [c.303] [c.111] [c.152] [c.153] [c.240] [c.244] [c.255] [c.263] [c.27] [c.162] [c.150] [c.229] [c.297] [c.210] [c.212] [c.186] [c.90] [c.207] [c.256] [c.264] [c.343] [c.349] [c.371] [c.309]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология