Синтез фрагментов некоторых ферментов

Г. СИНТЕЗ ФРАГМЕНТОВ НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ [c.353]

Таким образом, теория предсказывает, а эксперимент, поставленный независимо, как будто бы подтверждает, что трудность построения синтетических сополимеров с фиксированной третичной структурой, воспроизводящейся от глобулы к глобуле во всяком случае в достаточно протяженных ее областях, принципиально преодолима путем самонастройки макромолекул с переменной первичной структурой. Обосновав эту возможность, мы делаем еще один шаг в обосновании самой возможности создания искусственного фермента. Для решения задачи необходимо прежде всего синтезировать сополимер с узким молекулярно-весовым распределением, растворимый в проектируемой реакционной среде и звенья которого содержат в качестве боковых групп фрагменты будущего активного центра (например, нуклеофилы, радикалы, способные к гидрофобному связыванию субстрата, и т. п.). Некоторые из этих фрагментов должны обладать достаточно высоким сродством друг к другу, чтобы в подходящих условиях вызывать конформационное превращение клубок—глобула. Кроме того, они должны обладать способностью в не слишком жестких условиях обмениваться местами на макромолекуле (например, в результате внутримолекулярной переэтерификации, переамидирования и т. п.). Тогда при синтезе сополимера (если синтез ведется путем обратимого полимераналогичного превращения) или при его последующей обработке в подходящих условиях будет происходить миграция боковых групп от звена к звену до тех пор, пока при данном составе последовательность их расположения в макромолекуле заданной длины не окажется оптимальной для существования компактной третичной структуры, которой соответствует минимальная свободная энергия системы. [c.295]

В последнее время проблема установления первичной структуры ферментов и других белков развивается весьма успешно. Доступность данных о первичной структуре белков послужила стимулом для попыток синтеза фрагментов некоторых ферментов. В частности, особое внимание исследователей было обращено в связи с этим на рибонуклеазу поджелудочной железы быка (рис. 73а). Так, Ричардс и Витаятиль [1811] установили, что при действии на рибонуклеазу бактериальной протеазы суб-тилизина происходит разрыв пептидной связи лишь между остатками Ala и Ser при этом отщепившийся N-концевой эйкозапептид (S-пептид) остается связанным с основной частью фермента (S-белком) при помощи нековалентных связей. После разделения S-пептида и S-белка каждый из них оказался биологически неактивным однако при смешивании S-пептида и S-белка в молярном соотношении 1 1 ферментативная активность полностью восстанавливается (рибонуклеаза S ). [c.353]

Этот термин применяют для обозначения весьма своеобразного и важного явления, в процессе которого штамм бактерий генотипически изменяется в результате поглощения нуклеиновой кислоты бактерий других типов. Экспериментально этого можно добиться, обрабатывая штамм бактерий, который хотят изменить, суспензией мертвых мацерирован-ных бактерий или же тщательно очищенного фильтрата другого штамма такой фильтрат содержит только ДНК (дезоксирибонуклеиновую кислоту). Эта нуклеиновая кислота состоит из множества разных отдельных молекул или фрагментов молекул, которые, возможно, служат носителями разных генов. Так, путем трансформации можно вызвать перенос генов, определяющих, например, некоторые свойства капсулы, устойчивость к разным антибиотикам и способность к синтезу некоторых ферментов. [c.244]

С того момента, как возникла репликационная вилка, для ДНК-полимеразы, синтезирующей ведущую цень, всегда есть спаренный 3 -коиец- необходимый ей для того, чтобы начать синтез новой цепи. Иначе обстоит дело с ДНК-полимеразой, ответственной за синтез отстающей цени. Ей требуется всего каких-нибудь 4 с для того, чтобы синтезировать один короткий фрагмент ДНК, после чего она должна переключиться на синтез совсем другого фермента на новом участке матричной цепи, расположенной на некотором расстоянии от первого (см. рис. 5-39). Для этого ей всякий раз нужна затравка со спаренным З -концом, а следовательно, нужен и механизм, способный производить такие затравки. В этот механизм входит фермент, называемый ДНК-праймазой. Она синтезирует из рибонуклеозидтрифосфатов короткие РНК-затравки (праймеры), состоящие у эукариот примерно из 10 нуклеотидов (рис. 5-42). Эти затравки синтезируются с определенными интервалами на матрице для отстающей цепи здесь их наращивает ДНК-нолимераза, начиная, таким образом, всякий раз новый фрагмент Оказаки. Молекула ДНК-полимеразы продолжает это наращивание до тех пор, пока она не достигнет РНК-затравки. присоединенной к 5 -концу предыдущего фрагмента ДНК. Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК, быстро удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК. Завершает процесс ДНК-лигаза, соединяющая З -конец нового фрагмента ДНК с 5 -концом предыдущего фрагмента (рис. 5-43). [c.291]

Еще разнообразнее наборы белков, участвующие в синтезе ДНК на двухнитевых матрицах. В этом случае поми.мо уже перечисленных, требуются, в частности, хеликазы, способствующие расплетанию родительского дуплекса в области репликационной вилки (см. гл. И), набор с рментов, необходимых для синтеза отстающей цепи (праймазы ферменты, удаляющие РНК-затравку ДНК-лигазы, сшивающие фрагменты Окадзаки), а также — часто — топоизомеразы, снимающие избыточное внутримолекулярное напряжение, возникающее в результате расплетания матричного дуплекса. В обще.м, процесс элонгации при репликации вирусных ДНК-геномов не отличается принципиально от этого процесса при синтезе клеточных ДНК- Единственно, что следует отметить,— это использование (в некоторых системах) вирус-специфических репликационных белков, которые по своей функции аналогичны белка.м, и.меющимся в незараженной клетке. [c.266]

Оказаки. Таким образом, синтез ДНК на двух матричных цепях исходной молекулы заметно различается. Новосинтезированная цепь которая синтезируется непрерывно, называется ведущей (англ. lea- ding), другая цепь называется запаздывающей (англ. lagging). Каждый фрагмент Оказаки имеет на 5 -конце несколько рибонуклеотидов— результат действия праймазы. Характерный размер фрагментов Оказаки различается для бактерий и эукариот у бактерий, они имеют длину около 1000 нуклеотидов, у эукариот они короче, порядка 100 нуклеотидов. Через некоторое время после синтеза РНК-затравки удаляются, бреши застраиваются ДНК-полимеразой,. а фрагменты сшиваются в одну ковалентно-непрерывную цепь ДНК предназначенным специально для этого ферментом, ДИК-лигазой. [c.54]

Под действием иротеолитических ферментов (иротеиназ) белки расщепляются на строго определенные фрагменты, называемые пептидами, с концевыми аминокислотами, соответствующими избирательности действия иротеиназ. Структура некоторых таких фрагментов неполного гидролиза доказана последующим химическим их синтезом. [c.51]

Среди РНК-вирусов есть такие, у которых РНК реплицируется прямо на матрице РНК. Однако у некоторых онкогенных (опухолеродных) РНК-вирусов вначале происходит синтез ДНК, контролируемый РНК, т.е. РНК служит матрицей для синтеза ДНК. Таким образом, информация, содержащаяся в вирусной РНК, передается на ДНК путем обратной транскрипции (при помощи фермента обратной транскриптазы см. упомянутую выше схему), Этот фермент можно выделить из клеток опухолей, вызываемых РНК-вирусамк. Он находит применение в генной инженерии (см. разд. 15.3.6). Если, например, в качестве носителя информации выделяют не фрагмент ДНК, а соответствующую мРНК, то последняя должна быть переписана в ДНК, которая и встраивается в плазмиду. При помощи обратной транскриптазы удается получить нужную ДНК in vitro. [c.439]

Поэтому промотор для транскрипции 5S-PHK находится внутри самого гена между положениями -Ь 55 и + 80. Фрагмент, содержащий эту область, способен осуществлять инициирование транскрипции любой ДНК на расстоянии 55 п. н. перед сайтом своей интеграции. Каким же образом РНК-полимераза инициирует синтез РНК в области, предшествующей расположению своего промотора Наиболее предпочтительное объяснение состоит в том, что размеры фермента позволяют ему одновременно связываться с промотором и взаимодействовать с областью, отстоящей от него на расстояние 55 п. н. Так же как и в случае с РНК-полимеразой II, геометрия связывания фермента с промотором должна определять местоположение стартовой точки, но пиримидины при этом не могут быть использованы при инициации. Поэтому фермент обладает некоторой свободой при выборе ближайшего пурина, участвующего в инициации. Конечно, между ферментами существуют различия так, РНК-полимераза II танавливает контакт с точкой старта, расположенной от п мотора по ходу транскрипции, тогда как РНК-полимераза III связывается в противоположной ориентации (при условии, что промотор является местом связывания). [c.155]

На первый взгляд казалось, что это наблюдение свидетельствует о функциональной заменимости ДНК-полимеразы I. Однако дальней-щие исследования показали, что мутация pol А не затрагивает 5 З -экзонуклеазной активности Pol I. Удалось получить добавочные температурочувствительные мутации гена polA, подавляющие 5 -> З -экзонуклеазную активность и летальные при рестриктивной температуре. На основании этих данных был сделан вывод о том, что 5 З -экзонуклеазная активность Pol I является жизненно важной функцией, необходимой для удаления РНК-затравок при репликации, т.е. для обеспечения нормального синтеза полноценной отстающей цепи ДНК (рис. 13.3). В действительности для исходного ро/Л-мутанта было показано, что фрагменты Оказаки встраиваются в протяженные участки цепи ДНК с некоторым запаздыванием, и это свидетельствовало о возможном участии ДНК-полимеразы I в заполнении пустот, возникающих после удаления РНК-затравок из отстающей цепи. В то же время эту функцию Poll нельзя назвать жизненно важной, поскольку в polA-мутантном штамме с ней вполне успешно справляется фермент Pol 1П. [c.116]

В качестве примера механизма такого типа дифференцировки клетки можно привести перестройку у бактерии Salmonella. В этом случае определенный фрагмент ДНК размером 1000 нуклеотидных пар инвертируется в ходе реакции, катализируемой ферментом сайт-специфической рекомбинации (рис. 10-28). Итак, ДНК в этом сайте может находиться в двух состояниях Влияние инверсии на экспрессию гена объясняется тем, что внутри фрагмента размером 1000 нуклеотидных пар находится промотор, ответственный за синтез определенного белка (названного флагеллином), который локализован на поверхности бактериальной клетки. Если этот промотор находится в одной ориентации, го образуется белок одного типа, а если промотор оказывается в другой ориентации-синтезируется другой белок. Поскольку такое переключение происходит очень редко, клоны клеток растут с одним или другим типом флагеллина. Этот феномен носит название фазовой вариации. Скорее всего такой механизм дифференцировки помогает популяции бактерий защищаться от иммунного ответа организма хозяина. Если у хозяина образуются антитела к одному типу флагеллина. некоторые бактерии, флагеллин которых оказался измененным вследствие перестройки генов, смогут выжить и размножиться. [c.200]

Однако продукты распада клеточной стенки, стимулируемые вторгающимся патогеном, могут оказаться полезными в качестве самых первых сигналов об опасности, грозящей клеткам растения-хозяина. Клетки, контактирующие с патогеном, обычно синтезируют низкомолекулярные продукты, которые называются фитоалексинами и представляют собой антибиотики, токсичные для определенных патогенных бактерий и грибов. В настоящее время идентифицированы некоторые соединения, ответственные за стимуляцию биосинтеза фитоалексинов растением. Эти вещества, называемые элиситорами, представляют собой короткоцепочечные олигосахариды, образующиеся из полисахаридов клеточной стенки и проявляющие активность при очень низких концентрациях (10 - 10 ° М). Одним из первых хорошо охарактеризованных элиситоров является гепта-Р-глюкозид, выделяющийся из клеточной стенки гриба, поражающего сою (рис. 20-34). Олигосахаридные элиситоры синтеза фитоалексинов могут также продупироваться клеточной стенкой растений. В этом случае они представляют собой фрагменты пектинового скелета, построенного из остатков галактуроновой кислоты, которые высвобождаются из клеточной стенки растения при действии ферментов, секретируемых либо внедряющимся патогеном, либо в некоторых случаях ферментами растительной клетки, активированными при повреждении. [c.410]

Системы Y2H, не требующие активации или подавления транскрипции. Использование синтеза РНК для обнаружения взаимодействия белков друг с другом является с биохимической точки зрения очень сложным подходом. Его реализация требует переноса гибридных белков в ядро с последующим влиянием на аппарат транскрипции, что открывает большой простор для артефактов, часть которых была отмечена выше. В этой связи, усилия исследователей направлены на создание дигибридных систем, не зависящих от транскрипции генов-репортеров. Некоторые из таких систем основаны на появлении новой ферментативной активности после объединения двух гибридных белков, каждый из которых сам по себе ею не обладает. Один из вариантов дигибридных систем основан на обнаружении активности дигидрофолатредуктазы, которая появляется в результате объединения двух фрагментов полипептидной цепи данного фермента, что является одной из разновидностей генетической комплементации [131]. У дигидрофолатредуктазы N-концевой и С-концевой домены (1-105 и 106-186 а.о., соответственно) не приобретают правильной пространственной конформации, не объединившись друг с другом. На этом основании их ассоциацию обнаруживают по появлению ферментативной активности или способности взаимодействовать с конъюгатом ингибитора метотрексата с флуоресцеином. Описаны системы и на основе зеленого флуоресцирующего белка (GFP) [70]. [c.363]

Возможны два способа получения модифицированных ДНК-субетратов — химическая модификация канонического субстрата и введение модифицированного основания в ходе его синтеза. Субстраты синтезированые химическим методом имеют некоторые преимущества перед макромолекулярными ДНК. В первую очередь в олигонуклеотиды легче ввести задуманную модификацию при его конструировании, чем модифицировать природную ДНК, а затем убеждаться в полноте ее модификации. Применяя синтетические олигонуклеотиды, можно оценить расщепление сайта с различным нуклеотидным окружением в отсутствии других эффектов, например, сверхскрученности ДНК, неканонических вторичных структур (например, 2-ДНК или крестообразные структуры остова), а также неспецифического взаимодействия ферментов с другими сайтами. Для выяснения картины взаимодействия рестриктаз с ДНК, создаются синтетические ДНК-фрагменты имеющие [c.78]

Механизм, с помощью которого ДНК-полиме-раза катализирует полуконсервативньгй синтез новых цепей ДНК, был описан в разд. 2.1.д. Цепи удлиняются путем последовательного присоединения нуклеотидов к праймеру со свободной З -гид-роксильной группой выбор нуклеотидного остатка на каждом этапе определяется ДНК-матрицей. ДНК-полимераза I Е. соН катализирует и некоторые другие важные реакции. Две из них имеют особое значение для эи периментов с рекомбинантными ДНК это 3 ->5 - и 5 ->3 -экзонуклеазные реакции. В обоих случаях образуются продукты с 5 -фосфо-моноэфирными концами. Две указанные экзонуклеазные активности присуши разным участкам молекулы ДНК-полимеразы I, которые можно разделить, обработав белок протеолитическими ферментами. После разделения обнаруживается, что 3 —>5 -экзонук11еазная и полимеразная активности связаны с большим по размеру полипептидом, содержащим карбоксильную фуппу на конце, а5 ->3 -экзонуклеазнаяактивность-со вторым, более мелким фрагментом. [c.222]

Смотреть страницы где упоминается термин Синтез фрагментов некоторых ферментов: [c.353] [c.361] [c.300] [c.291] [c.80] [c.54] [c.108] [c.207] [c.408] [c.420] [c.107] [c.234] [c.170] [c.17] [c.66] [c.66] [c.84] [c.256] [c.411] [c.200] [c.410] [c.14]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология