Механизм с замещением фермент

МЕХАНИЗМЫ С ЗАМЕЩЕНИЕМ ФЕРМЕНТА [c.130]

Кинетический анализ двухсубстратных механизмов, предусматривающих образование замещенных производных фермента (фиг. 17), выявляет две характерные особенности этих механизмов 1) соответствующие им кинетические графики прямолинейны 2) графики, построенные для одного субстрата при различных постоянных концентрациях другого, дают одну и ту же величину отношения Таким образом, механизм с замещением фермента формально аналогичен механизму бесконкурентного торможения метод двойных обратных величин дает семейство параллельных прямых (фиг. 17). [c.130]

При графическом представлении зависимости от Л" наклон прямой не связан с членами, содержащими В. Аналогично прямые ио =/(В ) имеют один и тот же наклон при различных значениях А. Таким образом, прямые, выражающие зависимость от обратной концентрации одного из субстратов варьируемый субстрат) при различных постоянных концентрациях другого субстрата фиксированный субстрат) параллельны. Характерность таких графиков для механизмов с замещением фермента показана на большом числе примеров, а существующая в настоящее время строгая теория кинетического анализа в принципе позволяет исключать в таких случаях все другие мыслимые формы механизмов. Было также показано, что, даже если допустить образование тупиковых комплексов (т. е. непродуктивных комплексов В с Е и А с ЕК) в механизме с замещением ферментов, идентификация этой формы механизма не становится менее надежной [11]. Такое характерное двойное конкурентное ингибирование субстратами может даже значительно облегчить обнаружение замещенных форм фермента [12]. [c.132]

Как и в случае механизма с замещением фермента, все механизмы, характеризующиеся обязательным образованием тройного комплекса, можно проанализировать так же, как и механизмы с участием модификатора, разобранные в одной из предыдущих глав. [c.135]

Тщательному рассмотрению был подвергнут вопрос о том, при каких условиях механизм с образованием тройного комплекса может давать параллельные графики двойных обратных величин аналогично механизму с замещением фермента [14, 15]. Это могло бы, например, наблюдаться в том случае, если бы необратимость образования комплекса фермента с первым субстратом в механизме с тройным комплексом объяснялась какими-либо иными причинами, а не освобождением фермента от продукта реакции при нулевой концентрации продукта в растворе, как в механизме с замещением фермента. Довольно трудно представить себе обстоятельства, в которых это было бы в принципе затруднительно, и может, конечно, случиться, что имеющиеся данные о начальных скоростях процесса недостаточны для суждения о формальном механизме. Вероятно, в большинстве подобных случаев удобно использовать такие способы построения графиков (uq как функция Vol А или A/vo как функция А), дри которых отношение кажущихся величин Кт и V можно найти по величине отрезков на осях координат, а не по наклону прямых. Слейтер [16] предложил использовать иной метод —вычерчивать зависимость К от К рр, что в случае механизма с замещением фермента дает прямую, [c.141]

Выше несколько раз отмечалось, что кинетическая информация может быть обесценена, если неизвестно, какой субстрат присоединяется к ферменту первым. Чтобы выяснить это, можно использовать два способа изучение ингибирования продуктом реакции и изучение кинетики реакции со смесью субстратов. Суть первого метода иллюстрирует схемы, приведенные на фиг. 17 и 18 они показывают, что как в случае механизма с замещением фермента, так и в случае упорядоченного механизма с образованием тройного комплекса только первый субстрат и последний продукт реакции конкурируют друг с другом. Далее, только в случае механизма с замещением фермента, когда субстраты реагируют с ферментом в районе одного активного центра, первый продукт должен конкурировать с каким-либо субстратом, в данном случае (фиг. 17) со вторым субстратом. По этим соображениям определение начальной скорости процесса в присутствии каждого из продуктов реакций должно быть весьма полезным Ч При планировании таких экспериментов и их интерпретации должны быть получены ответы на следующие три вопроса [c.142]

Второй метод, разработанный Уонгом и Хейнсом [7], основан на использовании смесей субстратов. Рассмотрим, что произойдет, если в случае упорядоченного механизма для субстратов А и В будет использоваться смесь из двух субстратов, родственных А, которые мы назовем А] и Аг. Если А реагирует с ферментом первым, то субстрат В должен будет взаимодействовать с двумя формами фермента (А1Е) и (А2Е).В результате реакция будет иметь второй порядок по В и стандартные графики будут криволинейными, если только случайно не окажется, что А1 и Аг оказывают одинаковое влияние на Кт- Если же А является вторым субстратом и В реагирует со свободным ферментом, порядок реакции возрастать не будет. Таким образом можно выяснить последовательность присоединения субстратов к ферменту. Этот метод не применим в случае механизма с замещением фермента, поскольку при таком механизме оба субстрата не бывают одновременно связаны с ферментом. Следует заметить, что при использовании этого теста для выявления первого субстрата в упорядоченном механизме с образованием тройного комплекса отсутствуют упомянутые выше трудности, [c.143]

Данные, на основании которых был установлен этот механизм, приведены на фиг. 19. При низких постоянных концентрациях одного из субстратов графики двойных обратных величин для другого субстрата прямолинейны и почти параллельны, как в случае простого механизма с замещением фермента. При возрастании концентрации фиксированного субстрата наблюдается конкурентное ингибирование, вызывающее соответствующий сдвиг графиков. На графиках зависимости от наблюдается картина, характерная для субстратного ингибирования, особенно при низких значениях А. Те же данные, вычерченные в виде зависимости от Л", показывают, что при более высоких значениях В эффект конкурентного ингибирования- накладывается на простое смещение параллельных линий, вызываемое большими концентрациями фиксированного субстрата. [c.149]

Полученные кинетические данные характерны для механизма с замещением фермента, при котором два субстрата мешают друг другу. Никакой механизм с образованием тройного комплекса — включающий или не включающий конкурентные процессы ингибирования субстратом — не может давать такой кинетики. [c.151]

Рассмотрим случай механизма с замещением фермента [c.164]

Следовательно, если можно показать, что, скажем, несколько аналогов субстрата А дают различные значения V, а аналоги субстрата В дают одну и ту же величину V, то это означает, что константа fe+2 очень мала и лимитирует скорость V, т. е. V ж k+zEo. Если имеется возможность использовать несколько субстратов А, но лишь один-единственный субстрат В, то кинетический анализ все же возможен — при условии, что ряд субстратов А достаточно широк, чтобы величина V могла достигнуть максимального значения, определяемого константой k+i- Кинетический анализ такой реакции возможен также в тех случаях, когда химическая природа стадии, характеризующейся константой скорости fe+2, позволяет предсказать характер количественной зависимости этой константы от химической природы субстратов А. В таких случаях значение й+2 можно найти по величине V для медленных субстратов А, а значение k+i — либо непосредственно по лимитирующей величине V для более быстрых субстратов А, либо по разности между наблюдаемой и минимальной скоростью любой реакции, когда й+4 является существенным членом выражения для этой скорости. Заметим также, что симметричность механизма с замещением фермента позволяет использовать те же рассуждения для обратных случаев, когда k+i С к+2 и имеется возможность варьировать либо оба субстрата, либо лишь субстраты В, [c.164]

Если варьируемым субстратом является В, выражение имеет ту же форму (табл. 2). Полученный результат справедлив для любого механизма с замещением фермента. [c.170]

Кинетические коэффициенты для механизма с замещением фермента [c.170]

В ГЛ. IX указывалось, что для изучения механизма ферментативных процессов с образованием тройного комплекса может быть использован метод изотопного равновесия, разработанный Бойером [13]. Метод заключается в измерении начальной скорости перераспределения изотопа в процессе ферментативной реакции, при условии что перед добавлением изотопа система находилась в химическом равновесии. В настоящей главе мы рассмотрим, как с помощью этого метода можно измерить некоторые индивидуальные константы скорости в механизмах с замещением фермента . [c.173]

Многие ферментативные механизмы с замещением фермента характеризуются последовательностью процессов такого типа [c.173]

Начальная скорость наступления изотопного равновесия в реакциях, основанных на механизме с замещением фермента ) [c.176]

Механизм с замещением фермента является одновременно механизмом с упорядоченным присоединением субстратов. Однако это обстоятельство не имеет здесь такого значения, как для механизмов с образованием тройного комплекса, поскольку для механизмов с замещением фермента существует единственно возможный порядок присоединения субстратов и альтернативный вариант с неупорядоченным связыванием субстратов исключен хотя Е часто может связывать X или Y, образующиеся комплексы не способны к каталитическому распаду с образованием GX или GY. / [c.108]

Механизм с замещением фермента Кошланд назвал механизмом двухтактного замещения, поскольку за первоначальным замещением X атакующей группой В, принадлежащей молекуле фермента, следует замещение В вторым субстратом, Y [c.110]

Для механизма с замещением фермента уравнение скорости записывается следующим образом [c.117]

Для механизма с замещением фермента выражение для начальной скорости в отсутствие продукта имеет следующий вид [c.122]

Единственным вторичным графиком, необходимым для анализа механизма с замещением фермента, является график зависимости Ь/У аж от Ь, который имеет те же особенности, что [c.123]

Выводы, к которым мы пришли в предыдущем разделе, строго говоря, справедливы только при малых концентрациях субстрата, поскольку для всех реальных механизмов двухсубстратных ферментативных реакций по меньшей мере один из четырех реагентов может присоединяться к ошибочным формам фермента. В механизме с замещением фермента субстрат и продукт, в которых отсутствует переносимая группа, обычно присоединяются к ошибочной форме свободного фермента. В механизме с образованием тройного комплекса и неупорядоченным связыванием субстратов субстрат и продукт присоединяются к ошибочному двойному комплексу. В механизме с образованием тройного комплекса и упорядоченным связыванием субстратов к ошибочному двойному комплексу присоединяются либо второй субстрат, либо первый продукт, и субстратное ингибирование может наблюдаться либо для прямой, либо для обратной реакции (но не для обоих направлений), потому что только один из двух двойных комплексов может выступать в роли ошибочного . [c.124]

В механизме с замещением фермента в результате связывания В с Е образуется непродуктивный комплекс ЕВ. Комплекс ЕВ является тупиковым , и поэтому [ЕВ ]/ [Е ] = Ъ/К , где [c.126]

Рис. 5.8. Влияние ингибирования избытком субстрата Б (при = 10 К ) на первичные зависимости для механизмов с замещением фермента (сравните

Метод изотопного обмена позволяет упростить анализ ферментативной реакции, подчиняющейся механизму с замещением фермента, поскольку в этом случае можно изучать только половину реакции [c.137]

В связи с этими соображениями возникает два вопроса при каких обстоятельствах они приложимы и известны ли конкретные примеры таких механизмов действия ферментов Очевидно, что если фермент должен эффективно осуществлять эту, по сути дела, защитную функцию, он должен связывать данный метаболит очень прочно это означает, что в растворе должно содержаться мало свободного метаболита. Именно так обстоит дело со многими неустойчивыми метаболитами, напртимер аденилатами аминокислот при синтезе белка, которые существуют в связанной с ферментами форме. С логически крайним случаем такого рода мы имеем дело в реакциях двухсубстратного механизма с замещением фермента, в которых промежуточное соединение [уызывает модификацию какой-либо группировки самого фермента. Это либо окисление — восстановление простетической группы, ковалентно связанной с ферментом, либо замещение одной из группировок фермента группировкой первого субстрата. Такое промежуточное соединение может быть химически весьма неустойчивым, как, например, шиффово основание, образующееся в качестве промежуточного продукта в альдолазной реакции. Тем не менее выбор молекул, с которыми это промежуточное соединение действительно может реагировать, ограничен вследствие различий химического окружения в свободном растворе и на поверхности белка, [c.113]

Фиг. 17. Схематическое изображение механизма с замещением фермента (синонимы — механизм двухтактного замещения, механизм трансаминазного типа, механизм типа пинг-понг ) и соответствующие кинетические прямые.

Рассмотрим случай, когда роль модификатора Q играет второй субстрат В. На фиг. 18,/ показана схема упорядоченного механизма реакции (т. е. механизма с обязательной последовательностью присоединения субстратов), при котором образование продукта реакции и регенерация свободного фермента происходят при распаде тройного комплекса фермента с обоими субстратами. В терминах механизма односубстратной реакции это означает, что константа скорости распада (ЕА) с образованием продукта реакции и свободного фермента равна нулю и максимальная скорость определяется другими мономолекулярными стадиями. Здесь очевидна формальная аналогия со случаем неконкурентного ингибирования односубстратной реакции с той лишь разницей, что в данном случае реакция (ЕА) с В ускоряет, а не ингибирует образование продуктов. Помимо этого, рассматриваемый механизм отличается от механизма с замещением фермента тем, что реакции 1 и 2 в данном случае не разобщены в результате процесса освобождения продукта. Таким образом, как [c.135]

Вполне возможно также (и даже весьма вероятно), что все механизмы такого рода включают образование множества различных тройных комплексов. Такие комплексы могут образовываться либо одновременно, как, например, комплексы с ошибочной ориентацией (см. часть первую), либо последовательно один за другим по мере превращения субстратов в продукты реакции. Для последнего случая Блумфильд и сотр. [2] показали, что форма уравнения скорости реакции не зависит от числа промежуточных соединений, а величины констант скоростей, вычисленные на основании предположения о минимальном числе стадий, дают нижнюю оценку их истинной величины. Этот вывод верен также для случая механизма с замещением фермента. [c.141]

ГЛУТАМАТ - ОКСАЛОАЦЕТАТ-ТРАНСАМИНАЗА Хорошей иллюстрацией применения аналитического метода стационарной кинетики служит работа Хенсона и Клеланда [1] по изучению глутамат — оксалоацетат-трансаминазы. Кинетический механизм этой реакции относится к типу механизма с замещением фермента. Графики двойных обратных величин, построенные для каждого субстрата при разных концентрациях другого субстрата, имеют вид параллельных прямых. При изучении этой легко обратимой реакции как в прямом, так и в обратном направлениях результаты оказываются одинаковыми. Было исследовано также ингибирование процесса продуктами реакции с целью выяснить кинетическую значимость обоих возможных двойных комплексов. Оказалось, что обе кетокислоты строго конкурируют друг с другом и обычно не конкурируют с аминокислотами, и наоборот. Было также показано, что при высокой концентрации а-глутарата фермент образует тупиковый комплекс с этим субстратом. [c.147]

Бойер и его сотрудники исследовали изотопный обмен в различных двухсубстратных ферментативных реакциях, которые были достаточно детально исследованы методами стационарной кинетики [12—15]. Моррисон и Клеланд [3] изучили изотопный обмен в креа-тинкиназной реакции и получили данные, которые расширили представление о ее механизме, полученное при исследовании стационарной кинетики (см. выше). Розе и др. [16] с помощью этого метода окончательно установили, что реакция, катализируемая мышечной аль-долазой, основана на механизме с замещением фермента. Дальцилю и Дикинсону [17] принадлежит особенно интересная работа, в которой для исследования алкогольдегидрогеназы печени были использованы и методы стационарной кинетики, и методы изотопного обмена. Было установлено, что если субстратами являются вторичные спирты, то максимальная скорость реакции лимитируется распадом тройного комплекса, [c.152]

Примерами такого рода исследований могут служить исследования креатинкиназной реакции (механизм с образованием тройного комплекса) [2] и трансами-назной реакции (механизм с замещением фермента) [3], упоминавшиеся в гл. IX. [c.162]

Примером анализа механизма с замещением фермента, в котором были использованы аналоги субстратов, может служить упоминавшееся выше кинетическое исследование роданезы. В этой работе в качестве субстрата В был использован цианид, а в качестве варьируемых субстратов А применялись тиосульфат, а также ароматические и алифатические тиосульфонаты. При этом наблюдалось почти ЮО-кратное увеличение V при переходе от тиосульфата к метантиосульфонату и снижение V в случае ароматических субстратов [4]. Из этих данных следует, что величину V в случае тиосульфата определяет к+г. При использовании в качестве субстрата В липоата и в качестве субстрата А тиосульфата [1] было найдено, что обе мономолекулярные константы скорости влияют на величину V, и предварительное определение к+2 позволило рассчитать значение й+4 из приведенных выше соотношений. [c.165]

Рассмотрим механизм реакции, изображенный на фиг. 17. Это механизм с замещением фермента, примерами которого служат реакции, катализируемые трансаминазой, роданезой и аскорбатоксидазой. В этом случае одна из форм уравнения стационарной кинетики для [c.169]

ПО меньшей мере один концентрационный член. Другими словами, в уравнение скорости не должны входить члены, являющиеся константами. Развивая эти идеи, можно показать, что если в механизме имеются три подобные формы, то каждое слагаемое в уравнении скорости должно содержать по меньшей мере два концентрационных члена. Механизмы подобного типа называют механизмами с замещением фермента (substituted-enzyme me hanisms) они рассмотрены в гл. 5. [c.76]

Рис. 5.3. Механизм с замещением фермента для двухсубстратной-двухпродуктной реакции.

Как упоминалось ранее, определенные реакции, катализируемые биотинсодержащими ферментами, в основном следуют механизму с замещением фермента, однако эти реакции нетипичны в том отношении, что связывающие центры для X и Y независимы и наряду с замещенными формами фермента в качестве промежуточных соединений образуются тройные комплексы. В последующих разделах главы (и в литературе) под нормальным вариантом механизма с замещением фермента, если не делается специальных оговорок, подразумевается механизм с перекрывающимися или идентичными связывающими центрами для X и Y. [c.108]

Для любого из приведенных выше механизмов можно в качестве частного случая рассмотреть такую ситуацию, когда две или больше стадий протекают согласованно, т.е. представляют собой фактически единую стадию. Таким, например, является механизм Дудорова—Бэркера—Хессида, предложенный первоначально для сахарозо-глюкозилтрансферазы [45] и представляющий собой частный случай механизма с замещением фермента [c.108]

Предложенное Уоыгом и Хейнсом схематическое изображение реакций переноса групп с использованием обозначений X, и С особенно полезно для качественного обсуждения механизмов, проведенного в данном разделе, поскольку оно позволяет наглядно представить каждый выделенный механизм. Однако для количественного описания кинетики действия ферментов подобный подход оказывается непригодным, потому что в нем не проводится четкого разграничения между субстратами и продуктами кроме того, этот подход не позволяет обозначить концентрации реагентов простыми символами. Далее в этой главе мы вернемся поэтому к способу представления реагентов при помощи отдельных букв А, В,. .., Р, р.... В механизмах с образованием тройного комплекса и упорядоченным присоединением субстратов через А и Р обозначаются реагенты, которые связываются со свободным ферментом в механизме с неупорядоченным связыванием субстратов реагенты обозначаются произвольно в механизмах с замещением фермента принимается, что к Е присоединяются А и Р,акЕ — ВиР, хотя направление пути, связывающего Е с Е, выбирается произвольно. Эти правила можно легко обобщить на случай реакций, включающих более двух субстратов или продуктов. [c.111]

Из зтих параметров при изменении Ъ только один параметр — каж — меняется таким же образом, как и в случае механизмов с образованием тройного комплекса. Важным свойством механизма с замещением фермента является постоянство отношения каж/ м.каж ОНО равно V К - ка / м.каж не меняется при изменении Ь, однако в этом случае оно равно VIК. Первичные графики зависимости а/у от а или Ь/у от Ь представляют собой серии прямых, пересекающихся в одной точке, лежащей на оси а(и или Ь/у (рис.5.6). Такйм образом, за исключением довольно редкого случая, когда /С м между первичными графиками, соответствующими механизмам с замещением фермента и механизмам с образованием тройного комплекса, существует четкое различие (сравните рис.5.6 и 5.4). [c.123]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология