Молярная концентрация фермента определение

Определение содержания гема а в препарате цитохромоксидазы. В кювету спектрофотометра помещают 2 мл 0,1 М. фосфатного буфера (pH 7,4), содержащего 1,5%-ный холат натрия, и 0,1 мл полученного препарата. Измеряют оптическую плотность раствора при 605 нм. Затем фермент восстанавливают, добавляя несколько кристаллов дитионита. Через 10 мин регистрируют значение оптической плотности раствора при 605 нм. Концентрацию гема а рассчитывают, исходя из разности коэффициентов молярной экстинкции окисленной и восстановленной форм гема, которая при 605 нм составляет 12-10 см . Высокоочищенные препараты цитохромоксидазы, выделенные предложенным методом, содержат около 11 нмоль гема а на 1 мг белка фермента. [c.434]

Вопрос существенно осложняется, когда невозможно получить и исследовать индивидуальные ферменты, что пока является наиболее обычным случаем в энзимологии. Известное упрощение достигается, если фермент содержит в каталитическом центре в стехиометрическом количестве какой-либо кофермент (обязательный кофактор ферментативной реакции), который может быть определен аналитическими методами. Таким способом может быть измерена молярная концентрация фермента (соответственно, каталитических центров) в изучаемом неиндивидуальном ферментном препарате. [c.57]

Метод титрования активных центров, основанный на измерении начального всплеска, отличается от метода определения скорости ферментативной реакции тем, что он относительно нечувствителен к изменениям констант скорости. Для того чтобы получить воспроизводимые значения скорости ферментативной реакции, необходимо поддерживать строго определенные значения pH, температуры, концентраций компонентов буфера и т. д. В то же время при относительно больших изменениях константы к 2 вызываемых, например, химической модификацией фермента, величина начального всплеска остается неизменной, если только к 2 не уменьшается настолько, что ее уже не удается измерить. Таким образом, химическая модификация либо совсем не влияет на значение молярной концентрации фермента, получаемое описанным методом, либо вызывает снижение его до нуля. По этой причине метод титрования фермента был назван испытанием но принципу все или ничего [99]. [c.221]

Гиперболический характер рассматриваемой зависимости имеет значение также и для практики. В частности, поскольку для определения содержания фермента в препарате обычно используют субстрат в высокой концентрации, на результаты не влияют небольшие ошибки при отмеривании раствора субстрата, а также случайное присутствие ингибиторов данного фермента. Действительно, начальная скорость реакции прямо пропорциональна концентрации фермента при любой концентрации субстрата, за исключением крайнего случая, когда молярные концентрации субстрата и фермента по порядку величины близки. [c.41]

Методы, рассмотренные в этом разделе, позволили разработать важный способ определения концентрации фермента. В общем случае задача по определению точной молярной концентрации [c.220]

В ходе выделения фермента необходимо постоянно контролировать молярность сульфата аммония. Это осуществляют путем колориметрического определения концентрации иона NH4+ с реактивом Несслера (с. 87). [c.269]

Трудности вычисления связаны, конечно, не с измерением V, а с измерением молярной концентрации фермента. В тех сравнительно редких пока случаях, когда удается получить индивидуальный фермент и надежно измерить его молекулярный вес, определение концентрации фермента не представляет трудностей, а вместе с этим упрощается и нахождение константы k+ч. При этом, однако, необходимо иметь в виду, что фермент может содержать в молекуле не один, а несколько каталитических центров, или представлять собой ассоциат из нескольких субъединиц, из которых каждая содержит один каталитический центр. В этом случае молекулярный вес фермента или ассоциата дает возможность выразить молярную концентрацию [Е], однако рассчитанная на основе этих данных А+2 должна быть поделена на число каталитических центров в молекуле или ассоциате, поскольку индивидуальная ферментативная реакция, характеризуемая константой +2, происходит на одном каталитическом центре (согласно определению, данному в гл. И, эта константа — синоним понятия активности каталити-ческогоцентра). [c.57]

В связи с тем, что скорость ферментативной реакции находится 8 определенной зависимости от концентрации фермента, то и для этой последней величины необходим такой же, как и для концентрации субстратов, способ выражения (т. е. гмоли на литр раствора). Однако в настоящее время это возможно далеко не для всех ферментов, поскольку немногие из них получены в индивидуальном состоянии и не во всех случаях надежно определен молекулярный вес ферментов. Помимо того, как оказалось, в одной молекуле фермента может содержаться несколько каталитических центров, и, следовательно, концентрация фермента может быть не равна концентрации каталитических центров. Все это осложняет положение, хотя в некоторых случаях молярную концентрацию каталитических центров удается определить при помощи прямых или косвенных методов (см. гл. IX) и использовать эту величину для вычисления кинетических констант. [c.9]

Как следует из данных табл. 17, наибольшей молекулярной активностью обладает ацетилхолинэстераза нервной ткани электрического органа В. ele tri us. Значение УмЗ-Ю минГ , найденное Нахманзоном и Розенбергом на основании определения молекулярного веса методом седиментации и измерения удельной активности очищенного препарата фермента, отличается от других данных, приведенных в таблице. Причина этого расхождения состоит в том, что другие авторы использовали для расчета величины молярной концентрации каталитических центров, независимо от того, сколько этих центров приходится на молекулу фермента. Так, Мичел и Крон [104] определяли концентрацию каталитических центров по количеству Р -диизопропилфторфосфата, присоединившегося к ферменту. Лоулер [106] применяла для этих целей [c.171]

Как уже упоминалось, основные трудности при определении констант скорости реакции необратимого ингибитора с ферментом состояли в практической невозможности измерения молярной концентрации холинэстераз, а также в затруднениях регистрации хода реакции во времени из-за высокой скорости процесса даже при очень низких концентрациях ингибитора. Эти трудности былй преодолены путем измерения скорости реакции в условиях избытка ингибитора, когда бимолекулярная реакция может быть сведена к псевдомономолекулярной. [c.204]

Процесс взаимодействия ФОС с ХЭ представляет собой бимолекулярную реакцию [3] и, следовательно, для вычисления константы скорости ее необходимо экспериментальное определение изменения концентрации фермента и ингибитора в ходе реакции по времени. Это, однако, встречает трудности, так как мы не имеем фермента в индивидуальном состоянии и не имеем возмонлности выражать молярную концентрацию активных центров ХЭ и следить за ее изменением во время реакции. Помимо того, концентрация ФОС, вызывающая в течение короткого времени полное торможение активности фермента, столь мала, что для измерения ее изменений в ходе реакции нет подходящих аналитических методов. В целях преодоления этих трудностей нами были разработаны специальные методы, позволяющие изучать кинетику взаимодействия необратимых ингибиторов с ХЭ и вычислять константы скорости таких реакций [12]. С помощью этих методов было предпринято систематическое изучение специфической реакционноспособности ФОС. Исследование проведено совместными усилиями трех лабораторий по единому плану лаборатории М. И. Кабачника [c.428]

Приведенные выше рассуждения позволяют сделать вывод, что реакция протекает во времени, т. е. чем дольше ингибитор контак-тируется с ферментом, тем глубже торможение активности [70, 76]. Теоретически можно представить, что даже очень слабое антихолинэстеразное вещество может затормозить холинэстеразу на 100/О при достаточно продолжительном контакте. (На практике такие явления чрезвычайно редки [76] из-за одновременного процесса неспецифического фосфорилирования вследствие этого остатки аминокислот, не входящие в активный центр фермента, могут связывать ФОС.) Молярная концентрация ингибитора, вызывающая торможение фермента на 50%, называется ho- Этот параметр, а также величина р/50 (отрицательный десятичный логарифм До) изменяются во времени, поэтому они могут быть определены только при условии, если продолжительность инкубаций известна. Более достоверным параметром для определения силы ингибитора (т. е. его сродства с активными центрами холинэстеразы) является бимолекулярная константа скорости при определенных температуре и pH. Однако параметр ho значительно более распространен в литературе, так как его размерность (молярная концентрация) является более наглядной и облегчает вычисления в уме, а размерность бимолекулярной константы скорости л-моль- -мин-смущает всех своей сугубой химично-стью. В общем продолжительность инкубации, описанная в литературе, не слишком сильно отличается в разных работах (обычно эти различия лежат в пределах 1 час), так как почти всегда весь опыт — приготовление растворов, инкубация и определение активности —-занимает несколько часов. [c.98]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология