титрование активных центров

Рис. 28. Титрование активных центров иммобилизованных антител против IgG-человека конъюгатом IgG — ПХ (а) и представление результатов в координатах Скэтчарда (б)

После связывания ферментов с нерастворимыми носителями их свойства могут меняться либо под влиянием микроокружения, либо в результате изменений, вызванных химической модификацией благодаря образованию новых ковалентных связей. Следовательно, очень полезно охарактеризовать фермент не только определением общей ферментативной активности и количества связанного белка, но и путем титрования активных центров. [c.250]

Для иммобилизованных ферментов наряду с определением содержания связанного белка, общей или относительной активности дополнительную ценную информацию может дать также титрование активных центров. Примеры приведены в разд. 9.4. Некоторые методики для наблюдения за конформационными изменениями даны в разд. 9.5, а методы исследования распределения белков, связанных на поверхности нерастворимого носителя,— в разд. 9.6. [c.236]

ТИТРОВАНИЕ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ПРОТЕИНАЗ [c.250]

Рис. 4.12. Титрование активных центров изолейцил-тРНК—синтетазы с использованием только 10 мкг (100 пмоль) фермента (0,1 мл 1 мкМ раствора фермента). Последовательность реакций такова

Рис. 9.4. Диаграмма титрования активного центра [231.

Рис. 4.10. Принцип титрования активных центров.

Рис. 42. Титрование активных центров холинэстеразы ингибитором Гд-42

Рис.46. Титрование активного центра фермента

Значительно более прецизионный подход основан на титровании активных центров иммобилизованных антител меченым антигеном. В качестве метки целесообразно использовать низкомолекулярные соединения (изотоп, флуоресцирующий краситель, кофактор и т. д.), чтобы в максимальной степени снизить вероятность экранирования меткой антигенных детерминант. Суть метода заключается в насыщении микроколичеств иммуносорбента меченым антигеном. Получаемая в результате опыта изотерма адсорбции позволяет вычислять концентрацию и константы связывания иммобилизованных молекул антител. Так как в подобном эксперименте определяется не абсолютная концентрация активных центров антител, а концентрация центров, доступных для взаимодействия с антигеном, следует ожидать, что эта величина будет различной для антигенов с разными размерами и молекулярной массой. Например, при иммобилизации антител разной специфичности часть центров может экранироваться носителем от контакта с макромолекулярным антигеном, но быть доступной для низкомолекулярного. [c.218]

Титрование активных центров и начальный всплеск концентрации продукта [c.152]

Константа связывания антигена с иммобилизованными антителами. Степень сродства антител к антигену, количественно выраженная константой связывания, является основным параметром, определяющим чувствительность иммунохимического анализа. Процедура иммобилизации в ряде случаев может приводить к снижению константы связывания, что является одной из отрицательных сторон твердофазного анализа. Так, при сравнительном изучении антител к инсулину показано, что константа связывания антигена с иммобилизованными антителами в 20 раз ниже, чем в растворе. Экспериментально значения констант связывания получают из опытов по титрованию активных центров антител (рис. 28). [c.219]

Метод титрования активных центров, основанный на измерении начального всплеска, отличается от метода определения скорости ферментативной реакции тем, что он относительно нечувствителен к изменениям констант скорости. Для того чтобы получить воспроизводимые значения скорости ферментативной реакции, необходимо поддерживать строго определенные значения pH, температуры, концентраций компонентов буфера и т. д. В то же время при относительно больших изменениях константы к 2 вызываемых, например, химической модификацией фермента, величина начального всплеска остается неизменной, если только к 2 не уменьшается настолько, что ее уже не удается измерить. Таким образом, химическая модификация либо совсем не влияет на значение молярной концентрации фермента, получаемое описанным методом, либо вызывает снижение его до нуля. По этой причине метод титрования фермента был назван испытанием но принципу все или ничего [99]. [c.221]

Как правило, на график наносят зависимость наблюдаемой скорости от концентрации ингибитора. Точка пересечения с осью абсцисс дает значение концентрации активных центров (рис. 2.5). На рисунке приведены данные по титрованию активных центров с помощью необратимого ингибитора, иллюстрирующие этот подход. [c.97]

Для расчета констант скорости из данных стационарной кинетики и определения стехиометрии связывания необходимо знать концентрацию активных центров ферментов. Рассчитать эту величину исходя из молекулярного веса белка и его концентрации нельзя, поскольку не всегда удается выделить абсолютно чистый фермент. Проблема определения концентрации была решена путем применения метода титрования активных центров и сочетанием исследования ферментативных реакций в стационарных и предстационарных условиях, позволяющих связать концентрацию активной формы фермента с начальным всплеском концентрации продукта. Начальный всплеск наблюдается в тех случаях, когда по ходу реакции происходит накопление связанного с ферментом промежуточного соединения. Первый моль субстрата быстро реагирует с ферментом с образованием стехиометрических количеств фермент-содержащего промежуточного соединения и продукта, а дальше реакция замедляется, поскольку идет медленный распад промежуточного соединения с высвобождением свободного фермента [c.152]

Титрование активных центров применимо не всегда, поскольку для этого необходимо, чтобы в ходе реакции накапливалось [c.155]

Перед титрованием активных центров останавливают насос, вводят в систему реактор, содержащий фермент, включают насос с медленной скоростью, переворачивают реактор на короткое время, чтобы удалить из него воздух, и, наконец, повышают скорость циркуляции до 10 мл/мин. На рис. 9.4 показано увеличение светопоглощения в результате выброса и последующий после выброса гидролиз, записанные на диаграммной ленте самописца. Расгвор содержит большой избыток НФГБ относительно стехиометрического количества наблюдаемые на начальном участке диаграммы колебания объясняются небольшой пробкой п-нитрофенола в результате быстрой реакции приблизительно стехиометрического объема раствора титранта с ферментом, когда этот раствор проходит через реактор. Осцилляции быстро демпфируются, когда пробка разбивается , и концентрация -нитрофенола во всей системе становится постоянной. Выброс определяется путем простой экстраполяции начальной и последующей кинетических кривых гидролиза к началу контакта фермента и титранта. [c.251]

Титрование активного центра химотрипсина, ковалентно связанного с сефадексом 0-200, описано Гейблом [25], который в качестве титрующего агента использовал 4-метилумбеллифернл-п-(К, Ы-триметиламмоний)циннамат (МУТМАЦ). Этот флуорогенный титрующий активные центры реагент позволяет определять даже 0,02 нмоль фермента. [c.252]

Для Протеиназ, активность которых определяется единственной титруемой 5Н-группой, например для протеиназы из 51ер1ососсиз, можно использовать для титрования активных центров 5,5 -дитио-бис-(2-нитробензойную кислоту) (см. разд. 9.2.11). [c.252]

Однако в большинстве случаев интересуются не общим количеством связанных антител, а антителами, сохранившими способность к взаимодействию с антигеном после иммобилизации. Часть молекул антител Может утратить эту способность в результате присоединения к носителю антиген-связывающими центрами, стерического экранирования или других причин. Абсолютное число активных антител можно определить методом титрования активных центров антител антигеном. Существующие подходы позволяют проводить исследование с использованием как высоких, так и низких концентраций антигена и иммуносорбента. В первом случае иммуносорбент инкубируют с избытком антигена, затем диссоциируют специфический комплекс при pH 2—2,2 или раствором с высокой концентрацией солей (2—5 М) и определяют количество выделившегося антигена. Этот подход требует больших количеств сорбента и допускает возможность значительных ошибок вследствие смывания антител с носителя при эк пepимeнтaJJь-ных значениях pH или ионной силы. [c.218]

В ИФА титрование активных центров антител часто проводят конъюгатом антиген — фермент, в котором часть детерминант может быть экранирована маркером. В этом случае следует учитывать, что из числа доступных активных центров определяется концентрация только тех, которые специфичны к неэкранировай-ным антигенным детерминантам конъюгата. [c.218]

С учетом того, что сродство Са-АТФаз из различных источников к данному антителу одинаково, можно сделать вывод, что в препарате мембран из сердца концентрация АТФазы примерно в 5 раз ниже, чем в препарате из скелетной мышцы. Согласно этому критерию концентрации Са-АТФазы в микро-сомах из скелетной мышцы и в высокоочищенном препарате саркоплазматического ретикулума из сердца (получен высажде-нием мембранных пузырьков, утяжеленных оксалатом кальция) примерно одинаковы (рис. 28). С помощью такого своеобразного титрования активного центра Са-АТФазы высокоспецифическими ингибиторами, подобными моноклональному антителу, представляется возможным оценивать уровень фермента в гомогенатах не только мышц, но и других органов и тканей. [c.79]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология