Конъюгаты, приготовление

Для того чтобы продемонстрировать принцип иммуноферментного анализа, приведем результаты анализа иммуноглобулина, специфичного к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) в сыворотке крови пациентов. Этот показатель является очень важным как минимум по двум аспектам. Применительно к человеку, укушенному клещом, результат анализа показывает, достаточно ли устойчив человек к энцефалиту. А в случае использования крови здоровых доноров этот показатель свидетельствует о тйм, содержит ли кровь достаточное количество антивирусных антител, для того чтобы быть использованной для приготовления антивирусного иммуноглобулина. Последний может быть использован для введения человеку, укушенному клещом, для предотвращения развития инфекции. Известно, что поверхностный вирусный белок Е является основным антигеном ВКЭ. Этот белок можно достаточно прочно сорбировать на поверхности полистироль-ной пробирки. Если взять его в избытке, достаточном для количественного связывания антител к белку Е в образце, последние будут сорбированы практически полностью. После удаления образца добавляется конъюгат стафилококкового [c.258]

В этой реакции А. И. Николаев и И. Я. Усманова [40] предложили использовать в качестве антигенов центрифугаты смеси химического аллергена и гомологичного белка, который они рассматривали как комплексные белковые антигены, т. е. конъюгаты. Для их приготовления 1 часть химического вещества смешивают с 3 частями гомологичной сыворотки крови здорового субъекта (интактных лабораторных животных, доноров), доводят pH до 7,8—8,0, инкубируют сутки при -Ь4°С и освобождают от осадка центрифугированием. При этом, по данным авторов методики, в осадок выпадают альбумины и частично а- и р-глобулины, а относительная концентрация у-глобулинов в центрифугате увеличивается. Выбор для реакции в качестве антигена центрифугата, а не осадка, был сделан авторами на основании предположения о том, что пестициды образуют конъюгаты с у-глобулинами. Во всяком случае наличие химического вещества, хотя бы качественно, в осадке и центрифугате не определялось. [c.246]

Приготовление конъюгата антител с пероксидазой хрена (Ат-ПХ) [c.271]

Б. Приготовление конъюгатов гаптена с белком [c.167]

Приготовление конъюгатов СФ о — клетки селезенки. 1 — 2-10 клеток, суспендированных в 1 мл ЗФР-боратного буфера (pH 8,2), инкубируют 20 мин иа льду, добавив 50 мкл 1 мМ раствора СФ в ДМФ. [c.243]

На основании собственного опыта мы считаем, что лучшим способом оценки активности и специфичности конъюгатов может быть пробное окрашивание образцов клеток, их мембран или цитоплазмы. Действительно, классические контроли специфичности окрашивания, такие, как торможение избытком немеченых антител или адсорбция антисыворотки соответствующим антигеном, очень часто практически неосуществимы. В этих случаях однотипное окрашивание фиксированных мазков, приготовленных из клеток какой-либо другой ткани или другого вида, свидетельствуют о неспецифичности конъюгата. [c.172]

Приготовление конъюгатов ЩГС-МБ— -галактозидаза и [К-МБ— -галактозидаза ]. Присоединение КГС-МБ или К-МБ к i-галактозидазе в 0,05 М фосфатном буфере, pH 7,0 (буфер А), и очистку конъюгата [фермент-гаптен] на колонке с сефадексом G-25 проводили аналогично процессу получения и очистки конъюгата [Т4— -галактозидаза]. [c.267]

Иммуноанализ проводят следующим образом. Полистирольные пробирки (80X11 мм) покрываются антителами при обработке 1 мл раствора антител. Растворы антител разбавляют ОД М N a-карбонатного буфера (pH 9,8) или фосфатным (солевым) буфером. Пробирки с этими растворами оставляют на 3 ч при 37 °С для хранения раствор оставляют в пробирках на холоду. Перед определением необходимое число пробирок промывают 0,9%-ным хлоридом натрия, содержащим 0,05% твина 20. В каждую пробирку помещают 0,5 мл одного из следующих растворов 1) стандартный раствор иммуноглобулина G, 2) неизвестный образец, 3) буферный раствор. После этого добавляют 0,1 мл разбавленного конъюгата щелочной фосфатазы и иммуноглобулина G (приготовленного с помощью сщивапия глутаровым альдегидом). Для разбавления используют фосфатный (солевой) буферный раствор, содержащий 1% сывороточного альбумина человека и 0,02% азида натрия. Пробирки инкубируют при комнатной температуре в течение ночи (16 ч) на роторной мешалке так, чтобы поверхность, покрытая антителами, покрывалась 0,6 мл раствора, находящегося в каждой пробирке. Затем пробирки промывают три раза раствором Na l-твин. Количество фермента, присоединенного к иммуноглобулину G, связанному стенками пробирок, покрытых антителами, определяют, добавляя 1 мл 0,05 М Na-карбонатного буфера (pH 9,8), содержащего 1 мг/мл п-нитрофенилфосфата и 1 ммоль/л хлорида. магния. Через 30 мин реакцию останавливают, добавляя 0,1 мл 1 М ХаОН. Измеряют оптическую плотность при 400 нм и строят стандартный график зави-си.мости ферментативной активности (изменение оптической плотности в единицу времени) индивидуальных образцов от содержания в них иммуноглобулина G. [c.382]

Классические опыты Landsteiner (I936) показали, nto специфичность природных антигенов может быть изменена введением очень небольших молекул. При этом введенная химическая группа играла решающую роль в антигенной специфичности искусственно приготовленного конъюгата. Следовательно, антигенная специфичность различных иммуногенов может быть обусловлена небольшими участками в молекуле антигена. Такие участки получили название детерминант. [c.31]

Для приготовления конъюгатов смешивали 1 часть 0,1—0,01% стабилизированных в течение 1 нед растворов СгСЬ-бНгО и 9 частей растворов белков (САЧ, гам-ма-глобулин человека —ГГЧ и папаин) в 0,05 М растворе Na l с концентрацией белка 20 мг/мл. Инкубация при -f48° длилась И сут. Затем при 15 g осаждали денатурированную агрегированную фракцию, а элюат очищали от несвязавшегося хрома и белка путем гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-25, уравновешенной 0,05 М раствором Na l, и обеззараживали, пропуская через миллипоровые фильтры. Конъюгаты хранили при +4°С в ампулах. Образование конъюгата подтверждалось во время спектрофотометрии в видимой и ультрафиолетовой части спектра по смещению максимума поглощения. [c.43]

Следовательно, учитывая трудности приготовления in vitro конъюгатов, в аллергодиагностике можно использовать и чистые гаптены. [c.49]

Были сделаны попытки применения образующегося in vivo конъюгата, выделяемого из тканей лабораторных животных. Так, мы использовали в РПГА в качестве антигенов экстракты кожи морских свинок, смазанной 10% ацетоновыми растворами ДНХБ, эпоксифурфурило-вого эфира или эпоксидной смолы ДЭГ-1. Хотя, по нашим данным, такие антигены и не уступают в чувствительности искусственным конъюгатам [10], приготовление их достаточно сложно, так как различные химические аллергены образуют конъюгаты с различными белковыми фракциями эпидермиса и дермы, и скорость их всасывания колеблется в широких пределах [6]. Следовательно, и этот путь не подходит для практических целей. [c.216]

Растворяют 0,25 г очищенной п-оксифенилпропионовой кислоты в 50 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 8,0 (pH раствора смещается до 7,0). Приготовленный раствор субстрата добавляют в лунки микроплат (по 0,25 мл), содержащие иа стенках специфически сорбированные конъюгаты пероксидазы, иккуби-руют 5 мин при 30 °С и инициируют реакцию добавлением 0,05 мл 0,03%-ной Н2О2. Через 10—60 мин инкубации при 30 °С реакцию останавливают добавлением 0,2 мл 0,1 М глицин-NaOH буфера, pH 10,3. Измеряют интенсивность флуоресценции образцов (X возбуждения 320 нм, испускания — 405 им). [c.72]

Ротавирусный антиген, специфические антитела против ротавируса (АТ), конъюгат специфических антител с пероксидазой Ат-ПХ), антивидовые антитела против иммуноглобулинов быка, меченные пероксидазой (АтрПХ), положительные и отрицательные стандарты для выявления ротавируса и специфических антител, компоненты для приготовления субстратов на основе 5-АС (см. 1 этой главы), полистирольные планшеты, микропнпеткн, спектрофотометр. [c.273]

Антитела против тестостерона конъюгат тестостерона с соевым ингибитором трипсина (ТС-СИТ) меченные пероксидазой антивн-довые антитела стандартные растворы с известной концентрацией ТС реагенты для приготовления субстратной смеси на основе о-фенилендиамина полнсти-рольные планшеты для ИФА автоматические пипетки спектрофотометр, [c.281]

Приготовление конъюгатов ФИТЦюа — клетки селезенки. Взвесь, содержащую 10 клеток/мл, инкубируют 15 мнн при 37 °С в ЗФР (pH 8,7), к которому был прибавлен ФИТЦ до концентрации 100 мкг/мл. [c.243]

Ультразвуковой анализ хориогонадотропина человека. Смешивают 1 мл образца (мочи или буферного раствора) со 100 мкл реагента, приготовленного на 0,05 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,2, и содержащего в 1 л 0,1 моль хлорида натрия 0,25 г тритона QS-44 2,5 мг конъюгата антител с пероксидазой. Погружают в эту смесь индикаторную бумагу, воздействуют ультразвуком в течение 5 мин, переносят бумагу в проявитель (приготовленный на 0,05 М натрий-фосфатном буфере, pH 6,5,- и содержащий в 1 л 0,1 моль хлорида натрия 2 г бычьего сывороточного альбумина 300 мг 4-хлорнафтола 0,25 г тритона QS-44), инкубируют 10 мин при комнатной температуре и измеряют отражательную способность, как указано выше. [c.134]

Ферментативный иммунохроматографический метод. Добавляют 10—20 мкг образца (буферного раствора, сыворотки или цельной крови) к 1 мл ферментного реагента (приготовленного на 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0 и содержащего 0,2 моль хлорида натрия 0,2—1,0 мг конъюгата [теофиллин — пероксидаза] 100 мг глюкозооксидазы 2 г неиммунных IgG барана). В полученную смесь погружают край индикаторной полоски (4x90 мм), содержащей иммобилизованные антитела против теофиллина ( 30 мкг/см ),и дают растворителю подняться за счет капиллярных сил до противоположного края полоски (на это уходит 10 мин). Переносят полоску в проявитель (приготовленный на 0,01 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0, и содержащий в 1 л 0,02 моль хлорида натрия 0,5 г тритона QS-44 400 мг 4-хлорнафтола 0,05 моль глюкозы 2 г бычьего сывороточного альбумина). Через 5 мин на бумаге появляется голубая окрашенная область в форме ровной полосы или ракеты. Высота окрашенной области пропорциональна концентрации определяемого вещества. Для количественного анализа предварительно строят калибровочную кривую, отражающую зависимость высоты окрашенного фронта от концентрации теофиллина. [c.135]

Метод непрямого конкурентного анализа является вполне функциональным, хотя и весьма громоздким вследствие значительного числа этапов, составляющих процесс детектирования в a-ELISA. В лабораториях, где работают с a-ELISA, целесообразно использовать, этот метод для предварительного изучения принципиальных возможностей применения непрямого ИФА для тестирования данного антигена, поскольку для этого не потребуется приготовления каких-либо новых реагентов. Для последующей рутинной работы предпочтительно использовать конъюгат фермента с антителами к тестируемому антигену. [c.241]

Нацеливать аденовирус на определенные клетки, имеющие специфичные поверхностные антигены, наиболее просто удается с помощью конъюгатов (рис. 14.23). Данный подход реализован на различных раковых опухолях, для которых показана селективная трансдукция аденовирусными векторами встроенных в них трансгенов. Несмотря на очевидные достоинства, стратегия использования адаптерно-лиганд-ньк юмплексов имеет серьезный недостаток — многоступенчатость процедуры приготовления in vitro нацеленного гибридного аденовируса. [c.383]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология