Карбоксипептидаза Карта

Атомные модели карбоксипептидазы А получены совмещением последовательности 307 остатков с картой электронной плотности при номинальном разрешении 2 А [1—3]. Фазы отраженных рентгеновских лучей были определены методом изоморфного замещения с помощью четырех производных тяжелых атомов при разрешении 2,8 А и двух производных с разрешением, промежуточным между 2,0 и 2,8 А. В двух ртутных производных ртуть замещала цинк в активном центре (табл. 15.1). При совмещении полипептидной цепи с картой электронной плотности не возникло чрезмерных трудностей, хотя для некоторых остатков, например 133—137, электронная плотность была существенно меньше, чем в среднем по цепи. Оказалось, что остатки 138 и 161 соединены дисульфид-ным мостиком [1]. Как и ожидалось, наибольшая электронная плотность соответствовала иону цинка. При анализе карты электронной плотности было обнаружено, что цинк имеет три лиганда, соответствующие остаткам 69, 72 и 196. Остатки 69 и 72 были правильно идентифицированы как His и Glx [1]. Отождествление остатка 196 с Lys или Glx оказалось ошибочным [22]. [c.508]

Распределение остатков внутри и снаружи молекулы согласуется с данными для других глобулярных белков. Гидрофобные остатки предпочтительнее располагаются внутри молекулы, а заряженные группы — снаружи [52]. Поскольку участок в р-форме находится главным образом внутри глобулы, в нем обнаружено много гидрофобных аминокислот, в том числе лейцина и фенилаланина. Всего в контакте с водой не принимают участия 78 остатков. Из них 22 могут образовывать водородную связь с атомами пептидной связи или близлежащих остатков, и, по-видимому, эта возможность почти во всех случаях реализуется [3, 52]. Два остатка триптофана (63 и 147) и один остаток тирозина (238) спрятаны внутри молекулы КПА. Остальные остатки этих аминокислот находятся в частичном контакте с растворителем. Существование водородной связи между ОН-группой Туг-238 и карбонильной группой Glu-270, вероятно, имеет некоторое значение для конформационного изменения с участием Glu-270 при связывании субстрата, как описано ниже. Четыре из десяти остатков пролина расположены у N-концов спиральных участков, а три —у концов наиболее длинных цепей в слое с р-структурой. Во внутренней части молекулы находятся три карбоксильные группы, принадлежащие остаткам 104, 108 и 292. Конечно, справедливость этого утверждения зависит от того, насколько правильно установлен тот факт, что они являются свободными и не участвуют в образовании амидных связей. Карбоксильная группа Glu-292 образует солевой мостик с Arg-272, так что ее заряд локально нейтрализован. Детальное изучение карт электронной плотности обнаружило неизвестный ранее факт внедрения в молекулу карбоксипептидазы десяти молекул воды [52]. [c.514]

В присоединении цинка к карбоксипептидазе участвуют три белковых лиганда His-69, Glu-72 и His-196. Связи гистидин—цинк осуществляются через атом азота в положении Ni кольца. Кроме того, лиганды принимают участие и в других взаимодействиях. Атом азота N3 в His-69 образует водородную связь с остатком Asp-142, а атом азота N3 в His-196 соединен такой же связью с молекулой воды. На предварительных картах вблизи атома цинка была обнаружена повыщенная электронная плотность, не относящаяся к белку. С помощью карт, построенных по рассчитанным значениям фаз, удалось установить, что она принадлежит единственному небелковому лиганду металла. Поскольку величина электронной плотности соответствовала атому кислорода, было предположено, что он является молекулой воды или ОН-ионом. Понятно, что некоторые молекулы КПА вместо воды могут связывать 1 , однако малая величина электронной плотности свидетельствует о том, что их число невелико. Расположение лигандов относительно атома цинка показано на рис. 15.7, а значения углов [c.515]

Карты электронной плотности активного центра Hg-KПA были рассчитаны с высоким разрешением. Центр иона металла смещен на 1,0 А главным образом вдоль осей л и г/ по сравнению с положением иона цинка. На рис. 15.7 атом ртути был бы выше и ближе к остатку Н15-69. Связь этого металла с белком тоже осуществляется через атомы N1 двух остатков гистидина, 69 и 196, которые расположены так же, как в комплексе с 2п. Возможность поворота имидазольного кольца в Н1з-196, в результате чего в связи с металлом мог бы вместо атома N1 участвовать атом N3, следует исключить. Причиной этого является обнаружение на картах молекулы воды, которая, как и в случае цинка, соединена с атомом N3 этой аминокислоты водородной связью. Электронная плотность, соответствующая карбоксильной группе остатка С1и-72, несколько понижена. Тем не менее и эта группа, по-видимому, взаимодействует с атомом ртути. В остальном карты электронной плотности для комплексов белка с 2п и Нд совпадают. Возможность использовать Н -КПА при расчете фаз подтверждает изоморфизм двух структур. В растворе ртутное производное карбоксипептидазы проявляет высокую эстеразную активность, но не катализирует гидролиз пептидов [41]. Однако в кристаллическом виде Hg-iKПA в отличие от 2п-КПА обладает и высокой пептидазной активностью, которая составляет примерно 1/1000 активности 2п-фермента в растворе [73]. [c.525]

Основной особенностью вторичной структуры белка, как следует из карт электронной плотности с разрешением 2 А, является большая область р-конфигурации, занимающей центральную часть молекулы. По меньшей мере восемь таких фрагментов, направленных антипараллельно друг к другу, образуют изогнутую складчатую структуру. Еще три или четыре участка цепи также расположены параллельно или антипараллельно к этой структуре. В результате в центре глобулы образуется большая гидрофобная область. В этом отношении структура карбоангидразы очень похожа на строение карбоксипептидазы А [136, 137] (гл. 15). Три гистидиновых лиганда, связанных с ионом 2п(П),— тоже из этой р-конфигураци и. [c.611]

Насколько геометрические параметры реальных конформационных состояний полипептидной цепи отличаются от параметров так называемых вторичных структур, можно судить по рис. П.З, на котором показано распределение на конформационных картах ф—ф остатков некоторых сегментов цепей а-химотрипсина, карбоксипептидазы А и лизоцима [61]. Во всех исследованиях, посвященных поиску эмпирических корреляций, эти сегменты отнесены к а-спиральным или -структурным. Из рис. П.З видно, что в экспериментально наблюдаемых конформационных состояниях остатков, включенных при статистической обработке во вторичные структуры, значения двухгранных углов ф, ф не только не выражаются в точки ( фц, фц) и ( фр, фр), что должно иметь место при строгой регулярности структур, а обнаруживают существенный разброс в пределах а- и -областей. Более того, в ряде случаев значения ф, ф остатков а- и -сегментов вообще находятся в совершенно других местах конформационной карты. Если ограничить отклонения а-спиральных углов ф, ф от стандартных значений, например 15°, то в трех приведенных примерах в а-спиральных сегментах окажется не 41 остаток, а лишь 18 что же касается -структуры, то при таком ограничении углов ф, ф в нее не попадет больше двух остатков. Если же исключить из структур, считающихся вторичными, по три остатка с их N- и С-концов, которые, как правило, имеют большие отклонения по углам ф, ф или отвечают другим конформационным состояниям, то содержание в глобулярных белках участков, действительно близких к регулярным, уменьшится по сравнению с принятыми в литературе в 2—3 раза. При введении количественного критерия регулярности нельзя уже будет считать вторичными структурами большинство коротких а-спиралей и -структур, в том числе и большинство спиралей из 4—9 остатков, которые являются самыми распространенными в белках. В связи с тем, что в реальных белках вторичные структуры не обладают правильными регулярными формами, их идентификация субъективна и существенно отличается у разных авторов. Например, в лизоциме Чоу и Фасман [99] к а-спиралям и -структурам относят соответственно 54 и 21 остаток, а Бэржес и соавт. [101] — 46 и 4 в субтилизине BPN (отнесения [101] даны в скобках) — 86 (69) и 27 (44), в папаине — 54 (50) и 30 (21). Подобных примеров можно привести очень много. [c.269]

Для обнаружения С-концевой области А-белка бактериальной триптофансинтетазы сравнивали карты трипсинолиза белка до и после обработки его смесью карбоксипептидаз А и В [15]. С-Концевая последовательность этого белка имеет состав А1а-Ala-Thr-Arg-Ser, и при частичном триптическом гидролизе на пептидной карте обнаруживаются три пятна, соответствующие Ala-Ala-Thr-Arg-Ser, Ala-Ala-Thr-Arg и свободному Ser. После обработки карбоксипептидазами исчезает только пятно Ala-Ala-Thr-Arg, потому что второй пептид и свободный Ser мигрируют на хроматограмме, сливаясь с другими пятнами. Успешное использование этого метода сильно зависит от полноты разделения пептидов на хроматограмме. Чем крупнее молекула белка, тем больше вероятность того, что будет потерян С-концевой пептид. [c.485]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология