Ренатурация двойной спирали

Ранее П. Доти (США) и его сотрудники показали, что двойную спираль ДНК можно расплетать или денатурировать, применяя различные воздействия (повышение температуры, изменение pH и др.). В то же время, если инкубировать денатурированную одноцепочечную ДНК при температуре ниже той, которая вызывает денатурацию, комплементарные цепи реагируют между собою, вновь образуя двойную спираль, — происходит ренатурация ДНК. Если к ДНК добавить комплементарную РНК, может происходитьобразование гибридов ДНК—РНК — гибридизация, которая в дальнейшем стала одним из мощнейших методов изучения нуклеиновых кислот, позволяя выявлять комплементарные молекулы. [c.20]

Рис. 151. Образование гибридных двойных спиралей ДНК—ИРНК при совместной денатурации и ренатурации. (Опыты по центрифугированию в градненте плотности s l).

В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Она лежит в основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет выявлять степень сходства различных ДНК (а также РНК). Для этого денатурированную ДНК (если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей (ионная сила раствора — около 0,2 температу за — на 10—20 "С ниже Тт нативной ДНК). В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в двуспиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК (или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязав-шейся ДНК- Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК (или РНК), комплементарных другим ДНК (или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [c.30]

В простейшей форме комплементарные взаимодействия, играющие в общей рекомбинации центральную роль, можно воспроизвести в экспериментах ш vitro по ренатурации ДНК, разделенной на отдельные цепи. Такая ренатурация (или гибридизация) происходит, когда в растворе вследствие случайного соударения одиночных цепей ДНК комплементарные нуклеотидные последовательности оказываются одна напротив другой и образуют короткий отрезок двойной спирали. За этим сравнительно медленным этапом нуклеации спирали следует очень быстрый этап застегивания молнии двойная спираль при этом растет до тех пор, пока не образуется максимально возможное число водородных связей (рис. 5-59). Для образования таким путем новой двойной спирали разделившиеся цепи во время отжига должны быть выпрямлены, чтобы их основания были открытыми. По этой причине эксперименты с гибридизацией ДНК in vitro проводят при высокой температуре или в присутствии таких органических растворителей, как формамид в этих условиях плавятся и короткие спирали ( шпильки ), возникающие в одиночной цепи ДНК вследствие комплементарных взаимодействий при ее складывании саму на себя. Бактериальные клетки не переносят, разумеется, столь жестких воздействий. В них распрямление спиралей достигается под воздействием специального дестабилизирующего белка, или SSB-белка. У Е. oh SSB-белок необходим и для репликации ДНК, и для общей рекомбинации кооперативно связываясь с сахарофосфат- [c.304]

Ренатурация ДНК — процесс, обратный денатурации ДНК. Плавление гомогенных молекул ДНК — явление обратимое. При медленном охлаждении раствора ДНК, подвергнутого температурной обработке, разделенные цепи ДНК объединяются снова в двойную спираль. Быстрое охлаждение раствора ДНК характеризуется весьма [c.73]

Если оставшийся нерасплетенным двухцепочечный фрагмент ДНК, состоящий из десятка или большего числа комплементарных нуклеотидов, все еще продолжает удерживать цепи от полного расхождения, то процесс денатурации может быть легко обращен. Это значит, что при приведении температуры и величины pH вновь к физиологическим значениям расплетенные участки двух цепей самопроизвольно сплетутся, образуя исходный дуплекс (отжиг, рис. 27-14). Однако если расхождение цепей полностью завершено, то ренатурация будет происходить в два этапа. Первый из них протекает сравнительно медленно, поскольку две цепи должны отыскать друг друга в ходе случайных столкновений и образовать короткие комплементарные участки двойной спирали. Второй этап осуществляется гораздо быстрее, так как остальные основания последовательно состыковываются и образуют пары комплементарных оснований. Затем две цепи застегиваются наподобие молнии, вновь образуя двойную спираль. [c.865]

Ренатурацию денатурированных молекул ДНК можно проследить,, кроме того, по изменению поглощения ультрафиолетовых лучей. Так, инкубация при 65 °С образца ДНК, денатурированного при нагревании до температуры выше точки плавления ДНК, ведет к тому, что по мере образования двойной спирали и восстановления структуры стопки поглощение ультрафиолетовых лучей постепенно падает до самого низкого значения. Скорость, с которой происходит восстановление двойной спирали, в большей степени зависит от типа исследуемой ДНК. Например, если денатурированную ДНК пневмококков инкубируют в течение 1 при 65 °С, то поглощение падает от первоначального уровня, равного 1,4, до уровня, составляющего 1,2 соответствующего поглощения УФ-лучей нативной ДНК. Следовательно, можно заключить, что в течение этого времени вновь образуется примерно половина двойных спиралей. Денатурированная ДНК тимуса теленка реагирует иначе инкубация при 65 °С в течение 1 ч практически не приводит к ренатурации наоборот, ренатурация денатурированной ДНК бактериофага почти заканчивается в течение нескольких минут (фиг. 86). [c.181]

Раствор, содержащий равные количества ДНК, выделенной из культур В. subtilis. которые выращивались в средах NH4 I— НгО- и NHi l —Da, нагревали до температуры выше точки плавления ДНК и затем медленно охлаждали до 65 С для того, чтобы произошла ренатурация двойных спиралей. Раствор затем обрабатывали фосфодиэстеразой (ферментом, который расщепляет одноцепочечные, но не двухцепочечные полинуклеотидные цепи ДНК) и подвергали центрифугированию в градиенте плотности хлористого цезия. Обозначения на ординате и абсциссе соответствуют обозначениям иа фиг. 93. Поскольку на графике площадь каждой полосы пропорциональна количеству ДНК. [c.198]

Отметим, что в отличие от кривых титрования ДНК кривые титрования синтетических полинуклеотидов оказываются обратимыми. Это обусловлено восстановлением двойных спиралей при уменьшении электростатического взаимодействия. В ДНК из-за гетерогенности структуры ренатурация неполная, что приводит к несовпадению кривых прямого и обратного титрования. [c.32]

Как следует из фиг. 86, скорость, с которой объединяются отдельные комплементарные цепи ДНК при образовании интактной двойной спирали, зависит от генетической сложности организма, из которого эта ДНК была получена. Чем больше разных нуклеотидных последовательностей присутствует в денатурированном препарате ДНК, тем меньше вероятность, что за определенный промежуток времени данная полипептидная цепь спарится с комплементарной цепью. На фиг. 246 представлено графическое изображение экспериментального доказательства этого утверждения, полученного Бриттеном. Этот график изображает долю комплементарных цепей ДНК, объединившихся в двойную спираль в зависимости от нормированного времени 0 1. (Поскольку скорость ренатурации комплементарных цепей должна быть пропорциональна общей концентрации ДНК (Со), произведение Со на время (/), протекшее с начала эксперимента, дает не зависящую от концентрации величину нормированного времени, которая позволяет сравнивать результаты опытов, проведенных с разными концентрациями ДНК-) [c.503]

Гейдушек [350] показал, что обращение процесса тепловой денатурации протекает очень быстро, если две цепи отделены друг от друга неполностью. При этом возможна также перегруппировка двойных спиралей в системы, содержащие совершенно разные образцы ДНК. Возможность быстрой и полной ренатурации денатурированной метанолом ДНК [c.128]

Стрелки на логарифмической шкале сверху указывают размеры геномов (выраженные числом нуклеотидных пар основании). Денатурированные препараты ДНК фрагментировали механическим путем до размеров примерно в 400 нуклеотидов и инкубировали при температуре 60 °С предварительно было установлено, что эта температура является оптимальной для рол згурации двойных спиралей. Через определенные промежутки времени измеряли поглощение при 260 нм по изменению поглощения судили о степени ренатурации, поскольку при восстановлении двойной спирали поглощение уменьшается на 40% (см. гл. VIII). Уровень ренатурации. отложенный по оси ординат, вычисляли из значений УФ-поглощения А по формуле (А — А)/(А — А-), где А и А —соответственно поглощения полностью денатурированных и полностью нативных препаратов ДНК. По оси абсцисс отложено нормированное время Со/, т. е. произведение начальной концентрации денатурированной Д1-[К IR молях) нуклеотидов на 1 л за 1 с, прошедшую после того, как раствор был нагрет до 60 °С. r.t отложено в логарифмическом масштабе, очевидно, что Сг.Л необходимое для 50%-ной ренатурации. пропорционально количеству пар оснований в геноме организма, из которого была получена ДНК- / — поли-У -j- поли-Л // — сателлитная ДНК мыши ill — ДНК фага Т4 [c.504]

Хотя спираль нативной молекулы ДНК имеет более 10 витков, расчет показывает, что раскручивание спирали происходит всего лищь за несколько секунд. В опытах с ренатурацией ДНК охлаждение раствора длится час и более, и, следовательно, процесс ренатурации можно считать равновесным во всей области изменения температуры. Для восстановления двойных спиралей при медленном охлаждении требуется, чтобы вновь соединились цепи, комплементарные друг другу. Вероятность этого процесса тем больще, чем выше концентрация ДНК в растворе. В растворе гетерогенной ДНК могут также встретиться и соединиться друг с другом и некомплементарные цепи, но из-за несоответствия их нуклеотидного состава константа равновесия для таких агрегатов будет значительно меньше, чем для двойной спирали, образованной комплементарными цепями. Поэтому преимущественно должно происходить специфическое образование двойных спиралей из комплементарных цепей. Это подтверждают и эксперименты по трансформации. Оптимальная температура для восстановления трансформирующей активности примерно на 25° ниже температуры перехода нативной ДНК бактерий. [c.326]

Сообщение о денатурации и разделении цепей ДНК при повышенных температурах не вызвало большого удивления после того, как Уотсон и Крик предложили свою модель структуры ДНК. Зато открытие, сделанное в 1960 г. Мармуром, который показал, что двойная спираль может быть реконструирована из отдельных комплементарных полинуклеотидных цепей в растворе, было довольно неожиданным. Результаты одного из экспериментов Мармура приведены на фиг. 85. Слева на этом графике показана кинетика инактивации трансформирующей активности ДНК пневмококка при 100 °С. Как можно видеть, в течение 10 мин трансформирующая активность падает до уровня, составляющего менее 1% начального уровня, что происходит в результате денатурации и раскручивания молекул ДНК. Справа на этой фигуре показана трансформирующая активность образцов денатурированной ДНК, взятых через различные промежутки времени в течение 80-минутного периода, во время которого водяную баню медленно охлаждали от 100 до 60 °С. Видно, что во время охлаждения происходит постепенное восстановление активности, т. е. ренатурация двухцепочечных молекул ДНК, продолжающаяся до тех пор, пока уровень активности не достигнет 15% первоначального. [c.180]

Термин ренатурация (рис. 1-8) обозначает преобразование денатурированной формы в нативную структуру. В действительности структура ренатурировапной молекулы зависит от того, какие критерии используют для определения восстановления нативной конформации. В случае ДНК это относится к преобразованию отдельных полинуклеотидных нитей в двойную спираль. Для белков этот термин менее определенен. [c.22]

Определены оптимальные условия ренатурации ДНК после ее тепловой денатурации I308]. Концентрация ионов патрия должна быть выше 0,4 М, а температура на 25 ниже температуры плавления. Так как переход спираль — клубок воспроизводим (в отношении физических свойств и тепловой инактивации биологических маркеров), при охлаждении образуется та же вторичная структура, а сколько-нибудь заметного образования неспецифических водородных связей не происходит. Полнота ренатурации увеличивается с увеличением молекулярного веса ДНК и, как и следовало ожидать, заметно зависит от гомогенности препарата. Степень реконструкции вторичной структуры убывает в последовательности для ДНК из бактериофага > мелких бактерий > бактерий > животных тканей, и этот порядок отражает изменение числа различных молекул ДНК и различие нуклеотидного состава, которыми характеризуется каждый из источников ДНК 1308]. Как было показано фракционированием ренатурированной трансформируюшей ДНК при иомош,и ультрацентрифугирования в градиенте плотности, ренатурация не относится к процессам типа все или ничего>л а образование двойной спирали вновь после разрушения может происходить в различной степени [309]. В основном это есть результат случайного расщепления ковалентных связей в полин клеотид-ной цепи при нагревании. При стандартных условиях тепловой денатурации и последующего охлаждения можно рассчитать, что в каждой цепи ДНК с молекулярным весом 10 может происходить в среднем по три разрыва. Поэтому в процессе ренатурации будут участвовать комплементарные цепи с длиной, различающейся на i/i—1/2, что понижает ренату рацию на 20—30% [310]. Действительно, на микрофотографиях часто наблюдаются клубки на одном или на обоих концах ренатурированных цепей, которые соответствуют выступающим концам однотяжных цепей. [c.605]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология