Ренатурация комплементарных цепей

Ранее П. Доти (США) и его сотрудники показали, что двойную спираль ДНК можно расплетать или денатурировать, применяя различные воздействия (повышение температуры, изменение pH и др.). В то же время, если инкубировать денатурированную одноцепочечную ДНК при температуре ниже той, которая вызывает денатурацию, комплементарные цепи реагируют между собою, вновь образуя двойную спираль, — происходит ренатурация ДНК. Если к ДНК добавить комплементарную РНК, может происходитьобразование гибридов ДНК—РНК — гибридизация, которая в дальнейшем стала одним из мощнейших методов изучения нуклеиновых кислот, позволяя выявлять комплементарные молекулы. [c.20]

В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Она лежит в основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет выявлять степень сходства различных ДНК (а также РНК). Для этого денатурированную ДНК (если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей (ионная сила раствора — около 0,2 температу за — на 10—20 "С ниже Тт нативной ДНК). В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в двуспиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК (или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязав-шейся ДНК- Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК (или РНК), комплементарных другим ДНК (или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [c.30]

Ренатурация нуклеиновых кислот идет в два этапа. На первом в результате случайных столкновений одноцепочечных молекул происходит правильное соединение двух коротких комплементарных отрезков, а затем, как у молнии, идет быстрое схлопывание по всей длине с образованием полной двухцепочечной молекулы. Обычно скорость реакции лимитирует ее первая стадия, или стадия нуклеации. Естественно, что чем выше концентрация ДНК и чем она однороднее, тем чаще будут сталкиваться комплементарные цепи и тем быстрее будет идти реакция. Если весь геном организма уникален и в нем нет одинаковых участков, то скорость ренатурации при прочих рав- [c.20]

Как следует из фиг. 86, скорость, с которой объединяются отдельные комплементарные цепи ДНК при образовании интактной двойной спирали, зависит от генетической сложности организма, из которого эта ДНК была получена. Чем больше разных нуклеотидных последовательностей присутствует в денатурированном препарате ДНК, тем меньше вероятность, что за определенный промежуток времени данная полипептидная цепь спарится с комплементарной цепью. На фиг. 246 представлено графическое изображение экспериментального доказательства этого утверждения, полученного Бриттеном. Этот график изображает долю комплементарных цепей ДНК, объединившихся в двойную спираль в зависимости от нормированного времени 0 1. (Поскольку скорость ренатурации комплементарных цепей должна быть пропорциональна общей концентрации ДНК (Со), произведение Со на время (/), протекшее с начала эксперимента, дает не зависящую от концентрации величину нормированного времени, которая позволяет сравнивать результаты опытов, проведенных с разными концентрациями ДНК-) [c.503]

Рис. 8.4. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР. Реакцию проводят в двух пробирках, в каждой из которых содержится одинаковая двухцепочечная плазмидная ДНК, но разные наборы праймеров. Праймеры 1 и 3 содержат один неспаривающийся нуклеотид и комплементарны разным цепям плазмидной ДНК. Праймеры 2 и 4 полностью комплементарны соответствующим участкам плазмидной ДНК и тоже гибридизуются с разными цепями. Положение сайтов гибридизации для праймеров каждой пары различается, но их концы стыкуются. В результате ПЦР-амплификации образуются линейные молекулы. По окончании реакции содержимое пробирок смещивают и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. В результате кроме двух исходных линейных амплифицированных молекул образуются две кольцевые плазмидные ДНК, каждая с двумя одноцепочечными разрывами. После трансформации кольцевыми молекулами клеток Е. соН разрывы репарируются ферментами клетки-хозяина, и плазмида может реплицироваться независимо. Линейные молекулы ДНК в Е. oli не сохраняются.

Ренатурация комплементарных цепей ДНК при плавном (слева) и резком (справа) понижении температуры или pH раствора. [c.48]

Если оставшийся нерасплетенным двухцепочечный фрагмент ДНК, состоящий из десятка или большего числа комплементарных нуклеотидов, все еще продолжает удерживать цепи от полного расхождения, то процесс денатурации может быть легко обращен. Это значит, что при приведении температуры и величины pH вновь к физиологическим значениям расплетенные участки двух цепей самопроизвольно сплетутся, образуя исходный дуплекс (отжиг, рис. 27-14). Однако если расхождение цепей полностью завершено, то ренатурация будет происходить в два этапа. Первый из них протекает сравнительно медленно, поскольку две цепи должны отыскать друг друга в ходе случайных столкновений и образовать короткие комплементарные участки двойной спирали. Второй этап осуществляется гораздо быстрее, так как остальные основания последовательно состыковываются и образуют пары комплементарных оснований. Затем две цепи застегиваются наподобие молнии, вновь образуя двойную спираль. [c.865]

РЕНАТУРАЦИЯ КОМПЛЕМЕНТАРНЫХ ЦЕПЕЙ [c.347]

Хотя спираль нативной молекулы ДНК имеет более 10 витков, расчет показывает, что раскручивание спирали происходит всего лищь за несколько секунд. В опытах с ренатурацией ДНК охлаждение раствора длится час и более, и, следовательно, процесс ренатурации можно считать равновесным во всей области изменения температуры. Для восстановления двойных спиралей при медленном охлаждении требуется, чтобы вновь соединились цепи, комплементарные друг другу. Вероятность этого процесса тем больще, чем выше концентрация ДНК в растворе. В растворе гетерогенной ДНК могут также встретиться и соединиться друг с другом и некомплементарные цепи, но из-за несоответствия их нуклеотидного состава константа равновесия для таких агрегатов будет значительно меньше, чем для двойной спирали, образованной комплементарными цепями. Поэтому преимущественно должно происходить специфическое образование двойных спиралей из комплементарных цепей. Это подтверждают и эксперименты по трансформации. Оптимальная температура для восстановления трансформирующей активности примерно на 25° ниже температуры перехода нативной ДНК бактерий. [c.326]

Ренатурация легко проходит у фаговой ДНК, несколько труднее у бактериальной, но практически неосуществима у ДНК высших организмов. Если бы образцы ДНК, полученные из тимуса теленка, клеток Е. соИ и фага Т2 все имели молекулярный вес 10 , то число различных молекул ДНК, приходящееся на одну клетку (или частицу фага), составило бы соответственно 10 , lOO, 10. При одинаковой весовой концентрации эти три образца имели бы весьма различные концентрации комплементарных цепей, и вероятность встречи двух таких цепей, возникших при денатурации одной молекулы, в образце, полученном из клеток млекопитающих, была бы очень мала. [c.527]

Все это является свидетельством случайного сочетания комплементарных цепей в процессе ренатурации, в результате чего могут объединяться цепи, имеющие различную длину. [c.274]

Определены оптимальные условия ренатурации ДНК после ее тепловой денатурации I308]. Концентрация ионов патрия должна быть выше 0,4 М, а температура на 25 ниже температуры плавления. Так как переход спираль — клубок воспроизводим (в отношении физических свойств и тепловой инактивации биологических маркеров), при охлаждении образуется та же вторичная структура, а сколько-нибудь заметного образования неспецифических водородных связей не происходит. Полнота ренатурации увеличивается с увеличением молекулярного веса ДНК и, как и следовало ожидать, заметно зависит от гомогенности препарата. Степень реконструкции вторичной структуры убывает в последовательности для ДНК из бактериофага > мелких бактерий > бактерий > животных тканей, и этот порядок отражает изменение числа различных молекул ДНК и различие нуклеотидного состава, которыми характеризуется каждый из источников ДНК 1308]. Как было показано фракционированием ренатурированной трансформируюшей ДНК при иомош,и ультрацентрифугирования в градиенте плотности, ренатурация не относится к процессам типа все или ничего>л а образование двойной спирали вновь после разрушения может происходить в различной степени [309]. В основном это есть результат случайного расщепления ковалентных связей в полин клеотид-ной цепи при нагревании. При стандартных условиях тепловой денатурации и последующего охлаждения можно рассчитать, что в каждой цепи ДНК с молекулярным весом 10 может происходить в среднем по три разрыва. Поэтому в процессе ренатурации будут участвовать комплементарные цепи с длиной, различающейся на i/i—1/2, что понижает ренату рацию на 20—30% [310]. Действительно, на микрофотографиях часто наблюдаются клубки на одном или на обоих концах ренатурированных цепей, которые соответствуют выступающим концам однотяжных цепей. [c.605]

Ренатурации ДНК зависит от случайных столкновений комплементарных цепей таким образом, этот процесс подчиняется кинетике реакций второго порядка. Это означает, что скорость реакции определяется уравнением [c.224]

Такая структура формируется при ренатурации, когда одиночная цепь ДНК отжигается в одном конце с одной комплементарной цепью, а в другом конце-с независимой комплементарной цепью. [c.446]

Гибридизация (ренатурация) — взаимодействие комплементарных цепей ДНК (или ДНК и РНК), приводящее к образованию двухцепочечной молекулы. [c.352]

РЕНАТУРАЦИЯ. Реассоциация денатурированных комплементарных цепей ДНК с образованием двухцепочечной молекулы. [c.525]

К денатурации (плавлению) ДНК. Законы образования пар предсказывают, что при ренатурации две комплементарные цепи ДНК должны вновь соединиться с образованием исходной структуры. Это и происходит в действительности при медленном остывании (отжиге) раствора ДНК, подвергнутой тепловой денатурации. [c.36]

Для сравнительно коротких фрагментов (состоящих, скажем, из 10 пар оснований), концентрация которых очень мала, вполне разумно считать, что лимитирующим этапом процесса ренатурации ДНК является образование зародыша спиральной области. Мы будем предполагать, что каждый образованный зародыш мгновенно разрастается до максимальных возможных размеров спиральной области (рис. 23.19). Обозначим через АиВ изолированные комплементарные цепи, а через Сд и Ср — их концентрации. Пусть цепи смешиваются в момент времени / = 0. Образование двухцепочечного спирального ком- [c.347]

Конечным итогом денатурации при действии температуры, кислоты или щелочи может быть разделение цепей двухспиральной молекулы 3, Это следует из очень медленного восстановления свойств, характерных для исходной (нативной) ДНК, в процессе ренатурацин (см. ниже) после достаточно продолжительного инкубирования ДНК в условиях денатурации. С этим согласуется, кроме того, второй порядок скорости реакции ренатурации, данные электронной микроскопии з а также изменение гидродинамических характеристик молекулы при денатурации °з, збо Однако наиболее убедительным доказательством, по-видимому, является возможность разделения комплементарных цепей после денатурации 109. 185-195 [c.267]

Степень ренатурации, которая наблюдается на опыте, зависит от экспериментальных условий и от природы ДНК. Если резко понизить температуру раствора от значения, лежащего значительно выше 7" , до значения, лежащего намного ниже вероятность того, что разошедшиеся комплементарные цепи найдут друг друга, будет очень мала. Внут-рицепочечная вторичная структура, сформировавшаяся при охлаждении, будет очень стабильна, и восстановление нативной структуры окажется полностью блокированным. Такую ДНК обычно называют денатурированной, хотя считать ее одноцепочечной, как это часто делают, нельзя. В ней имеются двухцепочечные области, которые препятствуют ренатурации. Если вместо быстрого охлаждения производить медленный отжиг ДНК, постепенно понижая температуру раствора или в течение длительного времени поддерживая ее на одном уровне вблизи Т , то, хотя внутрицепочечные шпильки и будут образовываться, они будут не очень стабильны. Со временем сформируются правильные зародыши двухцепочечной формы, и по мере дальнейшего понижения температуры будет происходить их разрастание вплоть до образования нативной структуры. [c.343]

Другой интересной особенностью циклических ДНК, наблюдаемой при щелочной денатурации, является очень быстрая ренатурация при нейтрализации щелочного раствора такой денатурированной ДНК, если значение pH не превышает 12,5. При денатурации щелочью более высоких концентраций не удается добиться ренатурации (после нейтрализации) в условиях, когда ДНК II легко ренатурирует . Необратимо денатурированная ковалентно-замкнутая ДНК после нейтрализации и обработки панкреатической ДНК-зой спонтанно ренатурируетобразуя циклическую ДНК II с односпиральными разрывами данный процесс протекает значительно быстрее, чем ренатурация ДНК П. Это означает, по-видимому, что необратимая денатурация ДНК I происходит без разрыва цепей ДНК, однако в процессе денатурации они сдвигаются относительно друг друга вдоль оси спирали, после чего образование полностью комплементарной структуры при нейтрализации затруднено из-за случайного образования ненативных комплементарных пар 5 Возможно также, что воссоздание вновь исходной комплементарной структуры затруднено стерически из-за образования сверхспиральной структуры. Быстрая спонтанная ренатурация после образования единственного одноцепочечного разрыва объясняется, очевидно, тем, что при этом происходит быстрое раскручивание сверхспиральной денатурированной структуры и две цепи, находясь в непосредственной близости друг от друга, могут легко образовать полностью комплементарную двухспиральную структуру, как это происходит, например, при ренатурации денатурированной ДНК со сшивками между комплементарными цепя- [c.270]

В последние годы разработаны методы разделения комплементарных цепей ДНК при ренатурации отдельных нитей ДНК фага Я, каждая из которых не обладает биологической активностью (ке более 10% исходной), наблюдается восстановление биологической функции примерно наполовину Важно отметить, что взаимодействуют с образованием двухспиральнон молекулы только комплементарные цепи цепи одного типа не способны к ренатурации. [c.274]

Для проведения гибридизации клетки изучаемого штамма разрушают тем или иным способом (см. 8.1), выделяют ДНК, фрагментируют ее ультразвуком на кусочки длиной 300—350 пар оснований (определяется электрофорезом в 1%-ной агарозе), денатурируют нагреванием и закрепляют на нитроцеллюлозных фильтрах, ДНК сравниваемого штамма готовят таким же способом, вводят реактивную метку ник-трансляцией с помощью меченого нукле-озид-5 -трифосфата при одновременном действии ДНКазы 1 и ДНК полимеразы 1 Е. oli и используют для гибридизации. Ее чаще всего проводят по методу Денхардта в 20%-ном формамиде при 62° в течение 18—24 ч ( мягкая ренатурация ), отмывают от несвязавшейся меченой ДНК, и радиоактивность фильтров просчитывают в сцинтилляционном счетчике. Гибридизацию гомологичных ДНК принимают за 100% и рассчитывают проценты связанной исследуемой ДНК с ДНК реперного штамма. Процент связанной ДНК отражает степень гомологии молекул и служит показателем родства штаммов. Аналогичная реассоциация может быть осуществлена между молекулами ДНК и рРНК, поскольку двойные спирали образуются также между одноцепочечными ДНК и комплементарными цепями РНК. Подробнее методы описаны в справочном руководстве (Герхард и др,, 1984). [c.146]

Описано также поперечное связывание двух цепей в ДНК при действии азотистой кислоты и бифункционального алкилирующе-го агента, бис-(Р-хлорэтил)метиламина [81]. Такое образование поперечных связей приводит к полной обратимости свойств, возни-каюших у продукта при денатурации, даже у гетерогенной ДНК животного происхождения. Вероятно, точки поперечного связывания в двухтяжной структуре при процессах ренатурации играют роль центров, удерживающих смежные пары оснований. Так как образование поперечных связей под действием азотистой кислоты препятствует разделению комплементарных цепей, такой механизм может объяснить (помимо дезаминирования остатков, содержащих аминогруппы) мутагенную активность и, в особенности, ярко выраженный летальный характер азотистой кислоты [81]. [c.538]

Ясно, что ренатурация может быть легко достигнута для более однородных образцов ДНК (например, для тех препаратов, которые дают достаточно узкие зоны при ультрацентрифугировании в градиенте плотности), так как в растворах совершенно гомогенной ДНК после ее денатурации будет наибольшая концентрация комплементарных цепей. Таким образом, наиболее полно будут рена-турировать ДНК бактериофагов, в несколько меньшей степени бактериальные f ДНК и в значительно меньшей степени ДНК из животных тканей (например, из зобной железы теленка), которые весьма гетерогенны по составу (см. также стр. 601, где денатурация и ренатурация обсуждаются более детально). [c.580]

Денатурация—процесс обратимый, последующее восстановление двухцепочечной структуры ДНК может происходить даже при полном расхождении цепей. Процесс воссоединения, называемый ренатура-цией, реассоциацией или отжигом, происходит при понижении температуры или pH (рис. 1.12). Бели температура или pH понижаются постепенно, то цепи соединяются правильно, с восстановлением всех исходных пар оснований. При резком понижении температуры или pH правильное воссоедтшение комплементарных цепей затрудняется из-за спаривания оснований локально комплементарных участков в пределах одной или разных цепей (рис. 1.14). Диссоциация (денатурация) и реассоциация (ренатурация) ДНК в растворе являются по сути искусственным воссозданием процессов, ифаюших ключевую роль в реализации разнообразных биологических функций in vivo. Очень важным для дальнейшего изложения представляется то, что способность двух отдельных комплементарных цепей нуклеиновой кислоты воссоединяться с образованием исходной структуры является ключевым моментом для проведения соответствующих опы- [c.48]

Проведем теперь тот же самый эксперимент с ДНК коровы. Ее геном (3-10 пар нуклеотидов) превратится в 7 500 000 двухцепочечных фрагментов ДНК, а после нагревания — в 15 ООО ООО одноцепочечных. Если каждый фрагмент представлен единственной копией, то кривая реассоциации должна быть похожа на кривую, которая получается в опыте с фрагментами ДНК Е. oli. Но это не так (рис. 15-1, справа). Значит, некоторые фрагменты присутствуют во мпогих копиях. Их комплементарные цепи встречаются очень часто, и ренатурация идет очень быстро. Другие фрагменты представлены меньшим числом копий, их реассоциация идет медленнее, чем в первой группе, но все еще достаточно быстро. Эти повторяющиеся фрагменты составляют приблизительно 40% всей ДНК коровы Оставшиеся 60% фрагментов, вероятно, уникальны, и их реассоциация идет со скоростью, сравнимой со скоростью реассоциации фрагментов ДНК Е. соИ. [c.264]

А. Денатурация (диссоциация) двухцепочечной ДНК при повышении температуры раствора и ренатурация (реассоциация) двух комплементарных цепей при охлаждении, Б. Кривые денатурации типичной двухцепочечной ДНК, получаемые при повышении температуры и pH. и рН - это значения температуры и pH соответственно, при которых ДНК денатурирована (или ренатурирова-на) наполовину. [c.47]

Смотреть страницы где упоминается термин Ренатурация комплементарных цепей: [c.293] [c.30] [c.109] [c.196] [c.194] [c.275] [c.279] [c.580] [c.606] [c.198] [c.238] [c.36] [c.526] [c.238] [c.80] [c.65] [c.165] [c.119] [c.110] [c.234] [c.607] [c.245]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология