Векторы на основе бактериофага

Рис. 1.8. Клонирование ДНК в векторе на основе бактериофага X,

Векторы на основе бактериофага Л С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т. п. н. Однако при создании геномных библиотек час- [c.71]

Векторы на основе бактериофагов, содержащих одноцепочечную ДНК. Лучшие векторы такого типа разработаны на основе фага М13. В зрелую фаговую частицу входит одноцепочечная ДНК длиной 6500 нуклеотидов. После проникновения в клетку одноцепочечная ДНК фага превращается в двухцепочечную репликативную форму (РФ), которую выделяют из клеток и используют как вектор для клонирования. В инфицированной клетке накапливается 100—200 копий РФ ДНК. После этого синтез становится асимметричным и синтезируется лишь одна нить ДНК, которая входит в состав зрелого фага. Фаг М13 не убивает клетку, но лишь замедляет ее деление. Частицы зрелого фага непрерывно выделяются в среду, и их титр в культуральной жидкости может достигать 10 в 1 мл. [c.152]

Чтобы иметь возможность клонировать целый ген, донорную ДНК расщепляют лишь частично. При этом получаются фрагменты разной длины, из которых затем создают геномную библиотеку. Для клонирования крупных фрагментов ДНК были сконструированы векторы на основе бактериофагов X и Р1, а также плазмиды Р. [c.78]

Емкость клонирующих векторов была значительно повышена с появлением векторов, сконструированных на основе хромосомы бактериофага X. Получившие широкое распространение векторы серий haron, Xgtll и XBMBL обладают, по крайней мере, двумя существенными преимуществами перед плазмидными векторами. Во-первых, векторы на основе ДНК фага X обладают значительно большей емкостью, в них можно клонировать фрагменты ДНК длиной от 5 до 25 т.п.о. Во-вторых, фаговые частицы, содержащие упакованную ДНК, способны проходить литический цикл развития внутри бактериальных клеток и поэтому образовывать стерильные пятна (бляшки) на газоне бактерий. Такие бляшки содержат в концентрированном виде как сами фаговые [c.80]

Эукариотические вирусы до сих пор нашли более скромное применение в качестве векторов. Практически используются только онкогенный вирус SV 40 и его производные. Все эти векторы — дефектные вирусы, не способные давать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина. Анализируемую ДНК можно вводить и в другие репликоны, способные размножаться в клетках, например бактериофаги. Чаще всего из известных фагов в качестве векторов применяют сконструированные производные фага X и фагов М13 и fd. В векторах на основе бактериофага I. используется его особенность, состоящая в том, что большая часть его ДНК не участвует в размножении фага в клетке. Это позволяет вводить чужеродную ДНК в ДНК фага X в качестве вектора. [c.120]

Широко применяют также векторы на основе бактериофага Я. Извест- [c.274]

Рис. 10.13. Сконструированные участки ДНК из комбинаторной библиотеки кДНК Fv-фрагмента, клонированные в бактериофаг а. А и Б. Фрагменты ДНК L-( ) и Н-( ) цепей раздельно встроили в векторы на основе бактериофага а. В. Провели рестрикцию каждой iT oRI-библиотеки и лигировали фрагменты ДНК из библиотеки Н-цепи с фрагментами ДНК из библиотеки L-цепи, в результате чего получили комбинаторную библиотеку, содержащую все возможные сочетания фрагментов L- и Н-цепей с экспрессией соединенного фрагмента в одном векторе. pLa - /ас-промотор Е. соН, ССР - сайт связывания с рибосомой.

Первая глава данного тома касается использования плаз-мидных векторов, имеющих в своем составе высокоспецифичные промоторы РНК-полимераз некоторых бактериофагов. Такие векторные молекулы позволяют получать радиоактивно меченные зонды, которые благодаря своим уникальным свойствам все шире применяются сейчас в исследованиях структуры и функций нуклеиновых кислот. Подобные системы на основе космидных векторов рассматриваются во второй главе. Эти векторы разработаны для того, чтобы сделать менее трудоемкими прогулки по хромосомам высших организмов. Фаговые промоторы здесь расположены таким образом, что синтезируемый радиоактивно меченный зонд соответствует концевой области клонированной ДНК, а это облегчает поиск клонов, содержащих перекрывающиеся сегменты ДНК. [c.8]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

На основе бактериофага Я. были сконструированы векторы, в составе которых фрагменты чужеродной ДНК длиной до 22 т. н. п. весьма стабильны. При создании таких векторов для клонирования на основе фага А. учитывалось то обстоятельство, что вся центральная часть молекулы ДНК фага ( 19 т. н. п.) не нужна для репликации фага в Е. соИ. Эту область с помощью рестриктазы вырезают из генома фага так, что правый и левый концевые фрагменты (так называемые правое и левое плечо фага), необходимые для репликации, остаются неизменными. Плечи фага отделяют от остальных фрагментов и используют в качестве векторов для клонирования, содержащих на месте вырезанной фаговой ДНК вставку чужеродной ДНК размером около 9— 21 т. н. п. Размножаются в бактери-40 [c.40]

Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага Х. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей (рис. 10.13, Ап Б). [c.218]

Векторы на основе бактериофага X не очень пригодны для получения больших количеств белковых молекул. Чтобы решить эту проблему, сконструировали такой вектор, в котором ДНК Н-и L-цепей встраиваются в сайт, фланкированный плазмидной ДНК. Такую плазмиду, содержащую ДНК Н- и L-цепи, можно вырезать из вектора и трансформировать ею Е. oli (рис. 10.12). Являясь частью плазмиды, ДНК Fv-фрагментов будет многократно реплицироваться в клетках Е. соИ с образованием большого количества продукта, который можно использовать как в диагностическгк, так и в терапевтических целях. [c.219]

Большое разнообразие векторов существует на основе бактериофага в них используется особенность фага, состоящая в том, что значительная часть его ДНК не нужиа для размножения фага в клетке (рнс. 249). Это позволяет вводить чужеродную ДНК в ДНК фага к при использовании его в качестве вектора, причем длина вставляемого фрагмента может быть существенно больше величины фрагмента, встраиваемого в плазмиду. [c.432]

Векторы на основе бактериофага Я. Бактериофаг Я. — это вирус, размножающийся на бактериях Е. соИ. За последние 3U лет он стал излюбленным и наиболее изученным объектом генетиков и молекулярных биологов. Геном фага Я. представлен двуцепочечной ДНК размером в 48,5 т.п.о., которая упакована в головку фага в виде линейной молекулы с однонитевыми комплементарными концами длинои в 12 п.о. (липкие концы). После проникновения в клетку липкие концы объединяются и ДНК замыкается в кольцо. Кольцевая ДНК является репликативной формой. Возможность создания векторов на основе фага Я связана с тем его свойством, что гены центральной части (от I до N) несущественны для литического развития. Уже более 20 лет известны способы замещения центральной части фага сегментами бактериальной хромосомы путем определенных генетических манипуляций in vivo. Созданные таким образом специализированные трансдуцирующие фаги хорошо изучены. Идея провести манипуляцию замены центральной части ДНК фага Я in vitro на чужеродные фрагменты послужила поэтому логическим продолжением опытов in vivo. [c.147]

Джеффризу с соавторами [14] удалось впервые показать, что зонды на основе кор-последовательности ГВР могут быть использованы для одновременного выявления большого количества соответствующих генетических локусов. С помощью зонда, синтезированного путем тандемного лигирования 33 повторяющихся элементов ГВР из гена человеческого миоглобина, они обнаружили на Саузерн- блотах, несущих гидролизат геномной ДНК человека, картину из большого числа полос. Некоторые из них оказались полиморфными шоследовательностями. Для выделения этих родственных участков исследователи отобрали из геномной библиотеки соответствующие клоны, используя в качестве зонда при гибридизации в мягких условиях конкатенированные повторы из гена миоглобина. Когда же эти выделенные клоны, в свою очередь, выступили в роли зондов, с помощью некоторых из них в геномной ДНК удалось выявить сложную картину гипервариабельных полос. Клоны содержали последовательности, имеющие области гомологии с тандемными повторами миоглобиновых ГВР, которые и представляли собой общие для этой группы кор-последовательности. Последовательности этого семейства были названы минисателлитами. Для изучения доступны два из них, являющиеся вариантами основной кор-последовательности. Соответствующие зонды, названные 33.6 и 33.15, существуют в виде рекомбинантных форм векторов, полученных на основе бактериофага М13 [17] (рис. 1). Каждая из них выявляет около 15 высокополиморфных полос в диапазоне 4—20 т.п.н. Среднее значение гетерозиготности по [c.192]

НО, ЧТО средняя часть генома л не существенна для его литического размножения в Е. oli и может быть заменена на чужеродный фрагмент ДНК. Если размеры получаемой при этом ДНК не превышают предела (не более чем на 10 %), допустимого для упаковки в частицу фага, то образуются фаги с чужеродными фрагментами ДНК. В этом случае клонируемый участок ДНК хранят в виде частиц бактериофг(га или в виде клона бактерии с интегрированными гибридными профагами. Существует множество типов векторов, сконструированных на основе различных плазмид и различных бактериофагов. [c.274]

Искусственные хромосомы Р1. В заключение следует упомянуть о семействе векторов РАС (Р1-derived artifi ial hromosome), также часто используемых в современных исследованиях. Векторы этой серии содержат гены умеренного бактериофага Р1, обеспечивающие репликацию фаговой хромосомы в зараженных бактериальных клетках. Рекомбинантные ДНК на их основе (размер вставки 150-200 т.п.о.) также вводятся в бактериальные клетки с помощью электропорации. [c.94]

Для биологической защиты в зависимости от степени потенциальной опасности создаваемых рекДНК предусмотрены три уровня. Уровень Б1 (наиболее слабая защита) обеспечивается при использовании клеток Е. oh К-12 и векторов, полученных на основе неконъюгативных плазмид и бактериофагов, а также других клеток и векторов, обладающих сходной степенью безопасности. Уровень Б2 обеспечивается применением таких векторов и клеток, у которых вероятность перехода клонируемого фрагмента ДНК в окружающую среду составляет менее 10 . Уровень БЗ предусматривает использование систем вектор-клетка типа Б2, но испытанных на животных, включая и приматов, или апробированных в естественных экологических условиях. [c.475]

Следующее поколение плазмидных векторов, первыми представителями которого являются плазмиды pSP64 и pSP65, считать отдельным поколением несколько трудно по причине не очень значительного усовершенствования векторов предыдущего поколения, на основе которых они и были сконструированы. Однако тот факт, что практически все векторы общего назначения следующих поколений также содержат эти небольшие участки промоторных областей бактериофагов SP6, ТЗ или Т7, то их все же можно отнести к четвертому поколению. [c.226]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология