Олигонуклеотиды одноцепочечные

Рис. 5.9. Сборка синтетического гена из коротких олигонуклеотидов. Синтезируют отдельные олигонуклеотиды длиной от 20 до 60 звеньев каждый с такими нуклеотидными последовательностями, чтобы при отжиге из них образовалась двухцепочечная молекула. Оставшиеся одноцепочечные разрывы сшивают с помощью ДНК-лигазы Т4.

Рис. 8.1. Олигонуклеотид-направленный мутагенез. Одноцепочечную ДНК фага М13 (плюс-цепь), несущую ген-мишень, отжигают с комплементарным синтетическим олигонуклеотидом, содержащим одно основание, не комплементарное соответствующему основанию исходной ДНК. Олигонуклеотид служит затравкой для синтеза ДНК, а М13-вектор с встроенным геном — матрицей. Репликацию катализирует фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 Е. oli. Синтезированную полноразмерную цепь замыкает в кольцо ДНК-лигаза Т4. Образовавшимися двухцепочечными молекулами трансформируют Е. соИ. Часть фаговых частиц содержит ДНК дикого типа, часть — мутантную ДНК.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК Основной недостаток олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза с использованием фага М13 -большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага М13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК. Это позволяет обойтись без переноса Интересующего исследователя гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагенеза - обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину в середине последнего заменен один нуклеотид (рис. 8.3). Клетки Е. соИ трансформируют вектором, несущим ДНК-мишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеоти- [c.161]

Химический синтез палиндромных двухцепочечных олигонуклеотидов, получивших наименование линкеры (связывающие звенья) дает возможность клонировать любые фрагменты чужеродной ДНК безотносительно к специфичности сайтов рестрикции. Эти короткие тупоконечные (т.е. не обладающие одноцепочечными концами) молекулы двухцепочечной ДНК могут ДНК-лигазой фага Т4 ковалентно соединяться с произвольными тупоконечными фрагментами ДНК, которые мы хотим клонировать (рис. 9,13), Эти фрагменты могут выстригать- [c.279]

Рис. 5.10. Сборка протяженного гена in vitro с участием ферментов. Вначале химическими методами синтезируют отдельные олигонуклеотиды с такими нуклеотидными последовательностями, чтобы при отжиге между ними образовывались спаренные участки длиной 6—10 пар нуклеотидов. Оставшиеся между ними бреши заполняют с помощью ДНК-полимеразы I Е. соИ, а одноцепочечные разрывы сшивают ДНК-лигазой Т4.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевьгх молекул с [c.163]

Изучение олигонуклеотидов, выявившее, в частности, различия АДОВ и КД для 16 динуклеотидов [152, 153], дает основания надеяться на получение сведений о первичной структуре фрагментов нуклеиновых кислот. По-видимому, оптическую активность одноцепочечных полимеров можно представить в виде суммы вкладов димеров [154]. [c.320]

С разработкой быстрых и недорогих методов химического синтеза одноцепочечных ДНК-фрагментов с заданной нуклеотидной последовательностью методология молекулярного клонирования и характеризации ДНК существенно изменилась. Химически синтезированные олигонуклеотиды можно использовать для конструирования целых генов или их фрагментов, для амплификации специфических фрагментов [c.80]

Рис. 5.1. Химический синтез олигонуклеотида. После п циклов образуется одноцепочечный фрагмент ДНК из я -Ь 1 нуклеотида.

Одноцепочечные олигонуклеотиды из -17-24 звеньев используют в качестве праймеров при секвенировании ДНК и проведении ПЦР. [c.86]

С появлением приборов для автоматического химического синтеза ДНК (ДНК-синтезаторов) получение одноцепочечных олигонуклеотидов длиной <50 звеньев стало более или менее рутинной процедурой. Основным компонентом любого ДНК-синтезатора является система клапанов и насосов, с помощью которых в реакционную смесь по строго заданной программе вводятся нуклеотиды и реагенты, обеспечивающие присоединение нужных мономерных единиц к растущей цепи. В отличие от биологического, в ходе химического синтеза ДНК каждый новый нуклеотид можно присоединять к 5 -гидроксильному концу цепи. Все реакции осуществляются последовательно в одной реакционной колонке, а продолжительность каждой из них и время отмывания контролируются с помощью компъютера. [c.80]

Экзонуклеаза VII из Е. с о 11 специфична к одноцепочечным ДНК и отщепляет небольшие олигонуклеотиды как с 5 -, так и с З -концов ДНК. [c.311]

I по одноцепочечной ДНК-матрице с использованием небольшого затравочного олигонуклеотида (праймера), комплементарного определенному участку матрицы, и радиоактивных дезоксирибонуклеозид-трифосфатов. Для каждой матрицы проводят четыре независимые реакции полимеризации, при этом каждый раз [c.114]

В ходе Р. рост цеш1 осуществляется благодаря взаимод. дезоксирибонуклеозидтрифосфата с З -ОН концевым нуклеотидом уже построенной части ДНК при этом отщепляется ш1рофосфат и образуется фосфодиэфирная связь. Рост полинуклеотидной цепи (рис. 2) идет только с ее З -конца, т. е. в направлении 5 3 (см. Нуклеиновые кислоты). Фермент, катализирующий эту р-цшо,-ДНК-полиме-раза (см. Полидезоксирибонуклеотид-синтетазы)-пе способен начать матричный синтез на одноцепочечной ДНК, если нет хотя бы олигонуклеотидного биспирального участка (т. наз, затравочного ол ггонуклеотида) комплементарного матрице затравочным олигонуклеотидом во мн. случаях является не ДНК, а РНК. [c.252]

Рис. 8.4. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР. Реакцию проводят в двух пробирках, в каждой из которых содержится одинаковая двухцепочечная плазмидная ДНК, но разные наборы праймеров. Праймеры 1 и 3 содержат один неспаривающийся нуклеотид и комплементарны разным цепям плазмидной ДНК. Праймеры 2 и 4 полностью комплементарны соответствующим участкам плазмидной ДНК и тоже гибридизуются с разными цепями. Положение сайтов гибридизации для праймеров каждой пары различается, но их концы стыкуются. В результате ПЦР-амплификации образуются линейные молекулы. По окончании реакции содержимое пробирок смещивают и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. В результате кроме двух исходных линейных амплифицированных молекул образуются две кольцевые плазмидные ДНК, каждая с двумя одноцепочечными разрывами. После трансформации кольцевыми молекулами клеток Е. соН разрывы репарируются ферментами клетки-хозяина, и плазмида может реплицироваться независимо. Линейные молекулы ДНК в Е. oli не сохраняются.

Одноцепочечные олигонуклеотиды используют в качестве праймеров для сайт-специфического мутагенеза in vitro. [c.86]

На следующем этапе в реакционную смесь добавляют еще два олигонуклеотида, Е и Р. 3 -конец олигонуклеотида Е идентичен 5 "-концу олигонуклеотида С, а сам он отвечает участку реконструируемого гена, примыкающему слева к сегменту С. Аналогичными свойствами обладает олигонуклеотид Р, если его соотносить с олигонуклеотидом О. После денатурации и ре-натурации смеси образовавшиеся дуплексы с выступающими одноцепочечными участками достраиваются с 3"-гидроксильных концов. В ходе последующих раундов ПЦР образуется двухцепочечный продукт ЕСАВОР. [c.102]

Рис. 8.3. Олигонуклеотид-направлен-ный мутагенез с использованием плазмидной ДНК. Ген-мишень встраивают в полилинкер вектора pALTER. Плазмидную ДНК денатурируют в щелочи и отжигают с тремя олигонуклеотидами мутагенным олигонуклеотидом, олигонуклеотидом, восстанавливающим устойчивость к ампициллину (Amp ), и олигонуклеотидом, придающим чувствительность к тетрациклину (Tef ). Эти олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК с помощью ДНК-по-лимеразы Т4, а исходная цепь - матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются ДНК-лигазой Т4. Продуктами реакции трансформируют клетки Е. соН и отбирают трансформантов Amp и Tet.

ДНК — матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются с помощью ДНК-лигазы Т4. По окончании синтеза и лигирования продуктами реакции трансформируют клетки Е. соН. Трансформантов отбирают по признаку устойчивости к ампициллину и чувствительности к тетрациклину. Примерно 90% из них содержат специфическую мутацию в клонированном гене. У остальных трансформантов клонированный ген не был изменен либо потому, что олигонуклеотид не гибридизо-вался с ним, либо потому, что он вытеснялся в ходе синтеза ДНК. Клетки, несущие мутантный клонированный ген, идентифицируют с помощью гибридизации. Все плазмиды, штаммы, ферменты, олигонуклеотиды (кроме того, который предназначен для изменения клонированного гена), а также буферы продаются в наборе, что облегчает работу. [c.163]

РНК-лигаза катализирует ковалентное связывание одноцепочечных ДНК или РНК, при условии, что они содержат концевые З -ОН- и 5 -Р0<,-группы. Молекулы, содержащие З -ОН-группы, принято называть акцепторными, а 5 -Р04—донорными. В роли доноров выступают олигонуклеотиды и двухцепочечные ДНК. Минимальными донорами могут быть нуклеозид 3, 5 -дифос-фаты pNp и pdNp. Полирибонуклеотиды более эффективны в качестве акцепторов, чем полидезоксирибонуклеотиды. Трииуклеозид-дифосфаты NpNpN—ОН являются минимальными акцепторами. Эта реакция лигирования иллюстрируется схемой. [c.353]

Достижения в области изучения первичной структуры нуклеиновых кислот непосредственно связаны с развитием методов фракционирования олигонуклеотидов. Ускорению этих исследований способствовало наличие очищенных препаратов РНК и рибонуклеаз, специфически расщепляющих одноцепочечную молекулу РНК. К настоящему времени установлена полная нуклеотидная последовательность многих РНК, в том числе многочисленных тРНК, 5S- и 5,8S-PHK, информационных и рибосомальных РНК. Работы по определению первичной структуры ДНК начались несколько позднее, однако благодаря использованию электрофоретических методов, позволяющих быстро анализировать смеси, они вскоре достигли того же уровня, что и исследования РНК. Стратегия установления первичной структуры нуклеиновых кислот описана во многих превосходных обзорах [5, 121—123]. В настоящем разделе особое внимание уделено методам электрофореза на бумаге и в геле, используемым для разделения рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. [c.188]

Адаптер (Adaptor) 1. Синтетический двухцепочечный олигонуклеотид с одним тупым концом и одним липким. После пришивания адагггора тупым концом к ДНК-мишени последнюю можно встраивать в подходящий вектор, используя приобретенный ею липкий конец. 2. Синтетический одноцепочечный олигонуклеотид, у которого после самогибридизации появляются липкие концы и внутренний сайт для рестрицирующей эндонуклеазы. Когда адаптор встраивают в клонирующий вектор, у последнего появляется новый сайт рестрикции. [c.543]

Олигонуклеотид, олигомер (Oligonu leotide) Короткий (6—10 нуклеотидов) сегмент одноцепочечной ДНК. Обычно получают химическим путем. [c.555]

Хотя оба метода позволяют получать полинуклеотиды длиной до 100 нуклеотидов и более, с их помощью нельзя получить функциональные гены. Поэтому синтетические олиго- и полинуклеотиды, используемые для сборки гена, и в настоящее время сшивают способом, который на заре развития полинуклеотидно-го синтеза был предложен Г.Корана для соединения 20-мерных олигонуклеотидов, полученных фосфодиэфирным методом (рис. 83). Для соединения олигонуклеотидов I и II используется третий, вспомогательный, нуклеотид III, которых комплементарен 5 -концу одного и 3 -концу другого олигонуклеотида, образуя дуплекс с ником. Этот вспомогательный нуклеотид III играет роль матрицы для олигонуклеотидов I и II, причем его 3 -конец комплементарен 3 -концу олигонуклеотида II, а 5 -конец — 5 -концу олигонуклеотида I, несущего фосфомоноэфирную группу. Размер матрицы должен обеспечивать достаточную устойчивость дуплекса с ником, для чего каждый из сшиваемых олигонуклеотидов должен перекрывать матрицу III длиной по 8—10 пар нуклеотидов. Обработка комплекса олигонуклеотидов I, II и III ДНК-лигазой в присутствии доноров остатков АМР (АТР или NAD ) приводит к сшиванию олигонуклеотидов I и II. Как видно из рис. 83, двуцепочечный фрагмент образуется с выступающими одноцепочечными концами. Эти концы могут быть использованы для дальнейшего наращивания цепи. Для этого необходимо синтезировать олигонуклеотиды IV и V, частично перекрывающие выступающие 3 - и 5 -концевые фрагменты I — II нуклеотида. Обработка комплекса, содержащего олигонуклеотиды I — II, III, IV [c.298]

Затем температуру снижают до 45 — 65 °С (в зависимости от состава олигонуклеотидов) и выдерживают ее 1,0— 1,5 мин. При этом к образовавшимся в результате денатурации одноцепочечным ДНК присоединяются праймеры — один к 3 -концу выбранного для удвоения участка, второй — к 5 -концу. Этот этап называют отжигом . На третьем этапе поддерживается температура 72 °С. Это оптимальная температура для работы применяемой в ПЦР полимеразы. Данный фермент, используя дезоксинуклеозидтрифосфа-ты, содержащиеся в смеси, достраивает комплементарные цепи ДНК, начиная с 3 -концов праймеров навстречу друг другу. Этот этап называется элонгация (удлинение). [c.94]

Подобно экзонуклеазе I, экзонуклеаза II начинает разрушение иолидезоксирибонуклеотидной цепи с З -гидроксильного конца, освобождая последовательно дезоксирибонуклеозид-5-моно-фосфаты (фиг. 40). Однако в отличие от экзонуклеазы I этот фермент действует и на динуклеотиды. Так, экзонуклеаза II гидролизует олигонуклеотид фТфТфТфТфТ до 5фТ. Фермент этот быстрее действует на нативную (двухцепочечную) ДНК, чем на денатурированную (одноцепочечную) ДНК, и не разрушает олигонуклеотиды, содержащие З -фосфомоноэфирную группу не действует он и на РНК. [c.94]

Даже относительно бесструктурные полимеры, такие, как, например, денатурированная нагреванием ДНК или одноцепочечные гомополинуклеотиды, обнаруживают значительный остаточный гипохромизм. Это объясняется тем, что гипохромизм свойствен олигонуклеотидам и даже динуклеотидам соответствующей структуры. [c.144]

Нативная ДНК для панкреатической ДНК-азы служит более пригодным субстратом, чем денатурированная. Она действует на двухцепочечную ДНК,вызывая разрывы фосфодиэфирных связей в одной из полинуклеотидных цепей. Панкреатическая ДНКаза совершенно не чувствительна к малым олигонуклеотидам, апуриновым кислотам и к дезаминированным одноцепочечным ДНК. Под ее влиянием частично разрушаются некоторые биосинтетические полимеры. [c.65]

Эндонуклеаза IV — специфический фермент, гидролизующий одноцепочечную ДНК с образованием более мелких олигонуклеотидных фрагментов, чем те, которые получаются под действием эндонуклеазы П. Каждый из олигонуклеотидов содержит 5 -концевой фосфат, неизменно представленный ЦМФ. ДНК, в которых имеется оксиметилцитозин, эндонуклеазой IV не расщепляются. [c.89]

Для начала реакции синтеза ДНК ДНК-ревертазе, как и всем ДНК-по-лимеразам, необходима затравка в виде небольшого дву цепочечного отрезка. Если добавить в реакцию короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, состоящие из 18— 20 тиминовых остатков (поли дТ), то они будут гибридизоваться (образовывать по принципу комплементарности двуцепочечные ДНК-РНК-фрагменты) с поли(А)-последовательностью мРНК — и такой дуплекс будет служить затравкой для начала ферментативной реакции (рис. 1.9). В результате образуется гибридная РНК-ДНК-молекула, причем на конце у нее фермент будет синтезировать короткий отрезок двуцепочечной ДНК — шпильку. Шпилька может служить затравкой для синтеза второй комплементарной цепи ДНК, который осуществляет уже фермент ДНК-полимераза I (рис. 1.9). Цепь мРНК гидролизуют РНКазой. С помощью эндонуклеазы 81, которая специфически [c.43]

Отметим, что у образовавшейся здесь двухцепочечной молекулы кДНК отсутствуют липкие концы такие молекулы ДНК, с тупыми концами, можно клонировать при помощи нескольких процедур, сходных с той, какая представлена на рис. 5-78, хотя и менее эффективно. Можно, например, пришить к концам к ДНК синтетические олигонуклеотиды, содержащие участки, в которых рестрицирующий фермент вызывает разрыв, или присоединить ферментативным путем к концам молекулы к ДНК одноцепочечные хвосты , чтобы облегчить включение этой молекулы в клонирующий вектор присутствует лишь некодирующая ДНК. составляющая, как известно, большую часть массы такого генома (см. разд. 9.1.3). [c.329]

Можно не удалять сегменты ДНК, но вносить в них нуклеотидные замены. Для этого существует много способов. Например, можно синтезировать олигонуклеотид, имеющий ту же последовательность, что и сегмент исследуемого гена, но с одной нуклеотидной заменой. Если этот фрагмент сгибридизовать с одноцепочечной ДНК плазмиды или фага и затем достроить ДНК до полной двухцепочечной копии ДНК-полимеразой I, то при заражении бактерий такой ДНК будут получены колонии, содержащие нормальную, и колонии, содержащие измененную, мутантную ДНК. В настоящее время имеется много других методов, позволяющих вносить любые желаемые изменения в ДНК и затем с помощью клонирования нарабатывать эту измененную ДНК в больших количествах. [c.69]

Очень полезно, а иногда и просто необходимо иметь рестрикционную карту такой клонированной вставки ДНК. Расположение сайтов рестрикции, особенно тех, что встречаются лишь 1—2 раза во всей плазмиде, можно определить при помощи стандартных методик рестрикционного картирования [24]. Для обоих типов одноцепочечных зондов необходимо иметь единичный сайт рестрикции в участке тестируемой ДНК, дистальном по отношению к сайту связывания с РНК-полимеразой в случае РНК-зондов (см. разд. 5.1) или с олигонуклеотидами в случае ДНК-зондов (см. разд. 6.3 и рис. 10). После реассоциации одноцепочечного меченого ДНК-зонда с тестируемой ДНК может возникнуть необходимость расщепить гибридную последовательность ДНК на 2—3 фрагмента с оптимальной для ДГГЭ длиной. В этом случае надо использовать сайты рестрикции, имеющиеся в тестируемом фрагменте. [c.141]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология