Нуклеиновые кислоты ренатурация

Гипохромизм важен не только сам по себе, как чрезвычайно интересное оптическое явление, но главным образом как феномен, дающий нам в руки простой и удобный метод, который можно использовать в химии нуклеиновых кислот для качественной и количественной оценки процессов ориентации — дезориентации (таких, как денатурация, ренатурация, обратимое образование гомополимерных комплексов или образование гибридных спиралей ДНК — РНК), а также для установления генетической связи между ДНК из различных организмов или из различных клеток одного и того же организма. Все, что требуется для проведения такой оценки,— это спектрофотометр или какой-нибудь другой прибор, с помощью которого можно измерять поглощение света в области 260 ммк. Первый максимум поглощения у всех исследованных видов ДНК располагается в интервале 256—265 ммк вблизи 230 ммк находится минимум, а второй максимум поглощения лежит в далекой ультрафиолетовой области, при 195 ммк. Для обычных двухцепочечных ДНК коэффициент поглощения в расчете на 1 моль фосфора колеблется в пределах 6100—6900, что составляет 18,0—19,0 на 1 мг ДНК (для РНК соответствующая величина близка к 23). [c.144]

Описанные методы ренатурации в водных растворах требуют применения довольно высоких температур (порядка Гт —25°С), что приводит к деградации нуклеиновых кислот в процессе ренатурации. Если проводить ренатурацию в присутствии веществ, понижающих стабильность двойной спирали, например органических [c.279]

По температуре денатурации — ренатурации можно оценить степень комплементарности нуклеиновых оснований в цепях ДНК. Для денатурации сегментов ДНК, характеризующихся высоким уровнем комплементарности. требуются соответственно большие затраты энергии. Расхождение цепей таких фрагментов ДНК происходит соответственно при более высокой температуре. Это физическое явление используется на практике для определения степени сродства (гомологии) различных нуклеиновых кислот и лежит в основе метода гибридизации (одного из главных в генной инженерии). [c.36]

Ренатурация нуклеиновых кислот идет в два этапа. На первом в результате случайных столкновений одноцепочечных молекул происходит правильное соединение двух коротких комплементарных отрезков, а затем, как у молнии, идет быстрое схлопывание по всей длине с образованием полной двухцепочечной молекулы. Обычно скорость реакции лимитирует ее первая стадия, или стадия нуклеации. Естественно, что чем выше концентрация ДНК и чем она однороднее, тем чаще будут сталкиваться комплементарные цепи и тем быстрее будет идти реакция. Если весь геном организма уникален и в нем нет одинаковых участков, то скорость ренатурации при прочих рав- [c.20]

Мы остановимся здесь на кинетике переходов между одно- и двухцепочечными формами в простых модельных олигонуклеотидных комплексах, а затем покажем, как использовать эту информацию при анализе кинетики денатурации и ренатурации ДНК. Этот анализ послужит основой для выяснения количественных закономерностей гибридизации нуклеиновых кислот, одной из наиболее часто используемых методик в современной молекулярной биологии эукариот. [c.332]

Разумеется, без достаточных экспериментальных подтверждений мы не можем настаивать на таком объяснении, однако это и не так уже существенно. Важен надежно установленный экспериментальный факт для элюции нативной ДНК (или двунитевой РНК, а также гибридных молекул ДНК—РНК) с оксиапатита требуется почти вдвое более высокая концентрация фосфатного буфера, чем для элюции денатурированной ДНК или однонитевой РНК. Это обстоятельство открыло возможность быстрого и надежного отделения двунитевых молекул нуклеиновых кислот от однонитевых, что сыграло очень важную роль как в изучении структуры генома (исследования кинетики ренатурации), так и в развитии современных методов генной инженерии (гибридизация молекул НК и др.). Как и в случае кислых белков, присутствие даже относительно высоких концентраций неорганических солей в элюирующем буфере практически не сказывается на процессах элюции одно- и двунитевых молекул НК с оксиапатита. Вместе с тем, варьируя концентрацию Na l или КС1 в буфере, можно управлять изменением конформации самих нуклеиновых кислот, а также характером их гибридизации (например, отделять истинные , полноценные, гибридные молекулы от несовершенных гибридов ). [c.230]

А. Мармур и П. Доти Открыто явление ренатурации ДНК и установлены точность и специфичность реакции гибридизации нуклеиновых кислот [c.105]

Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали зависит от вероятности столкновения двух комплементарных нуклеотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Скорость реакции гибридизации можно использовать для определения концентрации любьсс последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к тому фрагменту, который надлежит выявить. Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо химическим путем, метят по Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочеч- [c.110]

В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Она лежит в основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет выявлять степень сходства различных ДНК (а также РНК). Для этого денатурированную ДНК (если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей (ионная сила раствора — около 0,2 температу за — на 10—20 "С ниже Тт нативной ДНК). В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в двуспиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК (или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязав-шейся ДНК- Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК (или РНК), комплементарных другим ДНК (или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [c.30]

Зависимость концентрации одноцепочечной ДНК от времени в процессе реакции ренатурации описывается гиперболической функцией (вывод формулы приводится в дополнении 9.1). График зависимости концентрации от времени при fej = 1 изображен на рис. 9.2. С помощью этого уравнения по времени необходимому для ренатурации половины исходного количества ДНК ( / q = 0,5), можно определять показатель реакции ренатурации ( oii/2)- Эта величина прямо пропорциональна числу нуклеотидов в неповторяющейся последовательности ДНК. Эта закономерность иллюстрируется на рис. 9.3 для нуклеиновых кислот, полученных из различных объектов. Другими словами, мы можем определить общий объем уникальной генетической информации, кодируемой ДНК, измеряя значение t i2 Более того, экспериментально определяя кривые ренатурации ДНК, мы можем установить присутствие в геноме повторяющейся генетической информации. [c.262]

Открытие повторяющихся последовательностей [27]. Примерно в те же годы начались исследования, позволившие установить другое фундаментальное отличие организации генома у высших организмов, а именно существование в нем многочисленных повторяющихся последовательностей. Эти работы были выполнены группой Р. Браттена (США). Авторы изучали процессы ренатурации и гибридизации нуклеиновых кислот. [c.20]

Ранее П. Доти (США) и его сотрудники показали, что двойную спираль ДНК можно расплетать или денатурировать, применяя различные воздействия (повышение температуры, изменение pH и др.). В то же время, если инкубировать денатурированную одноцепочечную ДНК при температуре ниже той, которая вызывает денатурацию, комплементарные цепи реагируют между собою, вновь образуя двойную спираль, — происходит ренатурация ДНК. Если к ДНК добавить комплементарную РНК, может происходитьобразование гибридов ДНК—РНК — гибридизация, которая в дальнейшем стала одним из мощнейших методов изучения нуклеиновых кислот, позволяя выявлять комплементарные молекулы. [c.20]

Денатурация—процесс обратимый, последующее восстановление двухцепочечной структуры ДНК может происходить даже при полном расхождении цепей. Процесс воссоединения, называемый ренатура-цией, реассоциацией или отжигом, происходит при понижении температуры или pH (рис. 1.12). Бели температура или pH понижаются постепенно, то цепи соединяются правильно, с восстановлением всех исходных пар оснований. При резком понижении температуры или pH правильное воссоедтшение комплементарных цепей затрудняется из-за спаривания оснований локально комплементарных участков в пределах одной или разных цепей (рис. 1.14). Диссоциация (денатурация) и реассоциация (ренатурация) ДНК в растворе являются по сути искусственным воссозданием процессов, ифаюших ключевую роль в реализации разнообразных биологических функций in vivo. Очень важным для дальнейшего изложения представляется то, что способность двух отдельных комплементарных цепей нуклеиновой кислоты воссоединяться с образованием исходной структуры является ключевым моментом для проведения соответствующих опы- [c.48]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология