Ренатурация ДНК скорость

Скорость процесса ренатурации ДНК обычно описывают уравнением [c.30]

Таблица 4.13. Зависимость скорости ренатурации от среднего молекулярного веса денатурированных ДНК и от сложности нативной ДНК

Биохнмич. эффекты высоких Д. При Д в неск. сотен МПа происходит денатурация белков, при этом меняются их антигенные св-ва, снижается активность токсинов. Особенно чувствительны к Д. процессы образования связей белок-лиганд и белок-белок. Так, для белков характерно значив уменьшение скорости ассоциации с повышением Д. (AV положительны и могут исчисляться сотнями см /моль). Денатурирующее влияние Д. зависит от природы белка, т-ры и pH среды. Напр., овальбумин необратимо коагулирует при 800 МПа, тогда как р-ры альбумина не претерпевают изменений даже при 1,9 ГПа. Д. может препятствовать тепловой денатурации белка и даже вызывать ренатурацию белка, де- [c.621]

Ренатурацию денатурированных молекул ДНК можно проследить,, кроме того, по изменению поглощения ультрафиолетовых лучей. Так, инкубация при 65 °С образца ДНК, денатурированного при нагревании до температуры выше точки плавления ДНК, ведет к тому, что по мере образования двойной спирали и восстановления структуры стопки поглощение ультрафиолетовых лучей постепенно падает до самого низкого значения. Скорость, с которой происходит восстановление двойной спирали, в большей степени зависит от типа исследуемой ДНК. Например, если денатурированную ДНК пневмококков инкубируют в течение 1 при 65 °С, то поглощение падает от первоначального уровня, равного 1,4, до уровня, составляющего 1,2 соответствующего поглощения УФ-лучей нативной ДНК. Следовательно, можно заключить, что в течение этого времени вновь образуется примерно половина двойных спиралей. Денатурированная ДНК тимуса теленка реагирует иначе инкубация при 65 °С в течение 1 ч практически не приводит к ренатурации наоборот, ренатурация денатурированной ДНК бактериофага почти заканчивается в течение нескольких минут (фиг. 86). [c.181]

Важнейшая особенность белковой цепи, определяющая существование необратимых флуктуаций и, следовательно, возможность спонтанного возникновения высокоорганизованной структуры из хаоса, заключена в специфической конформационной неоднородности природной аминокислотной последовательности. Можно утверждать, что суть рассматриваемого явления состоит в наличии четкой взаимообусловленности между химическим строением, конформационными свойствами и необратимыми флуктуациями. Гетерогенность аминокислотной последовательности ответственна за различие в конформационных возможностях ее отдельных участков, что, в свою очередь порождает термодинамическую неоднородность флуктуаций, дифференциацию их на обратимые равновесные и необратимые неравновесные. Сочетание последних и порядок их следования определяют содержание и направленность механизма быстрой и безошибочной самосборки белковой цепи. Отмеченная связь присуща только эволюционно отобранным аминокислотным последовательностям. В случае же гомогенных, регулярных или даже гетерогенных синтетических полипептидов со случайным порядком аминокислот тот же беспорядочный по своему характеру процесс не имеет развития и не выводит цепь из состояния статистического клубка. Сказанного, однако, недостаточно для объяснения высокой скорости сборки трехмерной структуры белка при его биосинтезе или ренатурации. Чтобы беспорядочно-поисковый механизм мог действительно привести к свертыванию цепи, селекция бифуркационных флуктуаций не должна представлять собой перебор возможных комбинаций всех случайных изменений целой полипептидной цепи, количество которых невероятно велико, и сборка структуры даже такого низкомолекулярного белка, как БПТИ, должна была бы продолжаться не менее 10 ° лет. [c.474]

Экспериментальное изучение многих белков, поддающихся ренатурации, выявило наиболее характерные черты этого явления самопроизвольность протекания, высокую скорость и безошибочность процесса сборки белковой цепи в нативную конформацию. Было показано, что структурная организация белка, несмотря на случайно-поисковый механизм сборки, осуществляется не путем перебора всех возможных конформационных состояний статистического клубка, а по определенному механизму, чувствительному к внешним условиям. При этом не было обнаружено фактов, противоречащих представлению о нативной конформации белковой молекулы как об энергетически глобальном равновесном состоянии. [c.471]

В результате изучения кинетики ренатурации целого ряда белков стали известны некоторые детали процесса свертывания-развертывания полипептидной цепи. Однако ни в одном случае эта работа не была доведена до логического конца, т.е. до установления конкретного механизма сборки и его количественного структурного, термодинамического и кинетического описания как многоступенчатого, взаимообусловленного на всех своих стадиях процесса. Не получили объяснения побудительные мотивы ренатурации, определяющие скорость процесса и его безошибочность, и, самое главное, возможность спонтанного перераспределения энтропии, т.е. самопроизвольного возникновения порядка из беспорядка. Уже десятки лет прогресс в этой области в теоретическом плане сдерживается из-за отсутствия количественной информации о состоянии и конформационных возможностях белковой цепи на разных стадиях ее самоорганизации и [c.471]

Как следует из фиг. 86, скорость, с которой объединяются отдельные комплементарные цепи ДНК при образовании интактной двойной спирали, зависит от генетической сложности организма, из которого эта ДНК была получена. Чем больше разных нуклеотидных последовательностей присутствует в денатурированном препарате ДНК, тем меньше вероятность, что за определенный промежуток времени данная полипептидная цепь спарится с комплементарной цепью. На фиг. 246 представлено графическое изображение экспериментального доказательства этого утверждения, полученного Бриттеном. Этот график изображает долю комплементарных цепей ДНК, объединившихся в двойную спираль в зависимости от нормированного времени 0 1. (Поскольку скорость ренатурации комплементарных цепей должна быть пропорциональна общей концентрации ДНК (Со), произведение Со на время (/), протекшее с начала эксперимента, дает не зависящую от концентрации величину нормированного времени, которая позволяет сравнивать результаты опытов, проведенных с разными концентрациями ДНК-) [c.503]

Для данной ДНК уменьшение ее молекулярного веса путем дробления сопровождается уменьшением константы скорости ренатурации 2, так что последняя все время остается пропорциональной корню квадратному из длины молекулы L (длина здесь определяется как средне число нуклеотидов в одноцепочечном полинуклеотиде) кп — УЬ. [c.275]

Сопоставление скорости ренатурации одинаковых по длине фрагментов, полученных из ДНК разной сложности, приводит к выводу, что скорость ренатурации обратно пропорциональна сложности Это обстоятельство дает принципиальную возможность определять сложность молекулы, т. е. для вирусных и бактериальных ДНК—молекулярный вес по кинетике ренатурации деградированных образцов ДНК, исходя из известной (например, определенной по константе седиментации) длины одноцепочечных фрагментов. Таким образом, при одинаковой длине ренатурирую- [c.275]

Можно показать, что константа скорости ренатурации определяется формулой [c.277]

Расхождение предсказаний теории и экспериментальных данных по зависимости скорости ренатурации от длины молекулы связано, возможно, с тем, что вследствие клубкообразного характера денатурированных молекул на все потенциальные ядра образуются с одинаковой скоростью, так как часть из них спрятана внутри клубка. [c.277]

Воздействие внешних условий. Зависимость константы скорости ренатурации ДНК от температуры имеет максимум при темпе- [c.277]

В интервале pH 5—9 скорость ренатурации не зависит от значения pH при более низких и более высоких значениях pH скорость ренатурации понижается вследствие ионизации оснований. [c.278]

В зависимости от температуры, при которой проводится ренатурация, ионная сила среды различным образом влияет на скорость процесса зе . При достаточно высоких температурах (60— 80° С), когда в цепях денатурированной ДНК практически нет внутримолекулярных двухспиральных участков, скорость ренатурации монотонно возрастает с увеличением ионной силы В усло- [c.278]

Наконец, константа скорости ренатурации обратно пропорциональна вязкости среды при постоянном значении разности между Гщ ДНК и температурой ренатурации. [c.278]

Причины наблюдаемой зависимости скорости ренатурации от температуры и вязкости в настоящее время являются предметом обсуждения 2 . [c.278]

Физические свойства растворов ДНК в этиловом и метиловом спиртах (полученных градиентным диализом) были детально изучены [288]. При этом макромолекулярные и оптические критерии (повышенная скорость седиментации, пониженная вязкость, уменьшенный радиус враш,ения, высокое оптическое поглощение) указывают на денатурацию. И хотя разрушение вторичной структуры, судя по макромолекулярным и оптическим критериям, протекает, по-видимому, полностью, денатурация в метанольном растворе происходит быстро, а при добавлении воды легко происходит ренатурация. При нагревании растворов с высоким содержанием метилового спирта также наблюдаются необратимые структурные переходы, но и в этом случае при добавлении воды происходит ренатурация. Таким образом, оказалось, что в метанольном растворе могут быть получены две формы денатурированной ДНК, причем обе они отличаются от ДНК, денатурированной в водном растворе [284]. Если денатурация ДНК многими органическими растворителями (включая диметилформамид) легко обратима при добавлении водных растворов электролитов, то денатурация в диметилсульфоксиде протекает необратимо [402]. [c.597]

В следующей главе будет подробно рассмотрено явление трансформации бактерий — перенос определенных, передаваемых потомству признаков, например устойчивости к определенному яду, с помощью ДНК, выделенной из устойчивого к яду штамма бактерий. Трансформирующая активность присуща только нативной форме ДНК. Измеряя ее, можно пользоваться этим показателем для количественной характеристики глубины денатурации и ренатурации ДНК. При изучении кинетики ренатурации ДНК выяснилось, что глубина процесса ренатурации, а также его скорость растут с концентрацией ДНК в растворе (рис. 85). [c.269]

При этой концентрации снята кривая рис. 86, на которой скорость ренатурации (вернее, глубина ренатурации, достигаемая в течение 1 часа отжига) отложена как функция температуры отжига. Опыты в этом случае ставились так же, как в эксперименте, изображенном на рис. 83, т. е. ДНК нагревалась, быстро охлаждалась, причем денатурированное состояние фиксировалось, а затем она отжигалась при постоянной температуре в течение [c.269]

Видно, что нормированное время, необходимое для 50%-ной ренатурации, различается в 10 раза для пяти исследованных препаратов полинуклеотидов. Наибольшая скорость ренатурации наблюдается в случае [c.503]

Различие в прочности сорбции на оксиапатите нативной (дву-нитевой) и денатурированной (однонитевой) ДНК широко используется для исследования структурного состава ДНК по скорости ее ренатурации в ходе отжига , для выявления однонитевых участков, для отделения гибридных молекул (ДНК—РНК) от однонитевых партнеров и др. [c.241]

Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали зависит от вероятности столкновения двух комплементарных нуклеотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Скорость реакции гибридизации можно использовать для определения концентрации любьсс последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к тому фрагменту, который надлежит выявить. Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо химическим путем, метят по Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочеч- [c.110]

Важнейшим достижением в изучении механизмов структурной организации белков явились экспериментальные исследования Крейтона 1970-1980-х годов, особенно его работы, посвященные эмпирическому подходу к изучению промежуточных состояний обратимой денатурации цистинсо-держащих белков [29, 30]. Разработанные Крейтоном методы позволяют Идентифицировать дисульфидные связи, регулировать скорость их образования и разрушения и по последовательности возникающих промежуточных MOHO-, ди- и т.д. S-S-продуктов следить за ходом свертывания белковой цепи. Предпринятое им на этой основе исследование пути свертывания панкреатического трипсинового ингибитора [29] опережает и сейчас, по прошествии двух десятилетий, научный уровень аналогичных работ по ренатурации других белков. Подход Крейтона, однако, неприемлем для белков, лишенных S-S-мостиков. [c.86]

Разработанный Ферштом эмпирический подход к изучению термодинамических и кинетических аспектов свертывания белковой цепи с привлечением сайт-направленного мутагенеза позволил автору и сотрудникам проанализировать все этапы формирования трехмерной структуры белка (барназы), не содержащего дисульфидных связей [31-33]. Изучение обратимой денатурации начинается с тщательного визуального анализа трехмерной структуры белка с целью выявления остатков, которые предположительно могут играть важную роль в структурной стабилизации и кинетике свертывания. Следующий этап заключается в модификации потенциально важных для сборки межостаточных взаимодействий путем специальных химических изменений белковых цепей актуальных остатков и сайт-направленного мутагенеза. Завершается этап составлением оптимального набора и его синтеза методами генной инженерии. Далее проводятся термодинамические и кинетические экспериментальные исследования механизма ренатурации (денатурации) нативного белка и мутантов, определения констант равновесия, констант скорости и величин изменений свободной энергии Гиббса стабильных структур, промежуточных и переходных состояний. Найденные значения используются для построения энергетических профилей путей свертывания белковых цепей дикого и мутантного типов. На их основе определяются разностные энергетические диаграммы, которые показывают различия в уровнях энергии всех состояний на пути свертывания белка и мутантов. Реализация описанной процедуры приводит к эмпирическим зависимостям между важными для свертывания белковой цепи взаимодействиями боковых цепей и параметрами, по мысли Фершта, характеризующими кинетику, равновесное состояние и механизм ренатурации [И]. Каждая мутация, которая в [c.87]

В представленном в этом разделе кратком описании расчетных методов нашли отражение основные тенденции развития конформационного анализа пептидов и белков в последнее время. Несмотря на многочисленность и видимое разнообразие новых теоретических разработок, их сближает ряд общих черт принципиального характера, причем тех же самых, что были присущи предшествующим теоретико-методологическим исследованиям. Отмечу лишь три таких особенности. Во-первых, практически все предложенные методы расчета исходят из предположения, что нативная трехмерная структура белка имеет самую низкую внутреннюю энергию. Поэтому конечная цель каждого метода состоит в установлении глобальной конформации молекулы по известной аминокислотной последовательности. Такое предположение, сформулированное более 40 лет назад, до сих пор не встретило каких-либо противоречий со стороны экспериментальных фактов и, следовательно, может считаться оправданным. Во-вторых, в последние годы, как и ранее, во всех случаях предпринимались попытки подойти к расчету глобальной конформации белка путем усовершенствования предсказательных алгоритмов, процедур минимизации и вычислительной техники. Надежды на решение структурной проблемы по-прежнему связываются не с более глубоким проникновением в молекулярную физику белка и разработкой соответствующих теорий, а главным образом с достижением в области методологии теоретического конформационного анализа и развитием компьютерной аппаратуры. Между тем такой подход в принципе не может привести к априорному расчету глобальной конформации белка. В разделе 2.1 уже указывалось, что перебор со скоростью вращательной флуктуации (10 с) всех мыслимых конформационных состояний даже у низкомолекулярной белковой цепи (< 100 остатков) занял бы не менее 10 лет. Следовательно, при беспорядочно-поисковом механизме сборка белка как в условиях in vivo в процессе рибосомного синтеза, так и в условиях in vitro в процессе ренатурации не может осуществляться через селекцию конформации всех локальных минимумов потенциальной поверхности. Реальные же возможности самых совершенных современных методов расчета ограничены независимым анализом тетра- и пентапептидов, рассчитанных четверть века назад. Ни один из существующих теоретических методов не в состоянии проводить конформационный анализ сложных олигопептидов, а тем более белков, без привлечения дополнительной информации - результатов прямого эксперимента, касающегося исследуемого объекта, или статистической обработки имеющихся структурных данных. В-третьих для всех предложенных методов расчета характерно отсутствие классификации пептидных структур, оправданной с физической точки зрения и [c.246]

Другим примером является инсулин, который не удается ренату- рировать, если его нативные дисульфидные связи были разрушены тиолами или если их структура менялась при ферментативных воздействиях [101]. Этот факт стимулировал поиски предшественни->ка, который был действительно обнаружен в форме проинсулина 442]. Проинсулин стабилен к действию фермента дисульфидизомеразы (рис. 4.3) в опытах по денатурации — ренатурации он самопроизвольно повторно свертывается [443]. Протеолитическое расщепление проинсулина in vivo приводит к инсулину, стабильность которо-го обеспечивается энтропийным вкладом его нативной системы связей "S—S (разд. 8.3). Лабильность структуры инсулина имеет, по-види- мо.му, физиологическое значение [444], поскольку скорость инактивации является фактором, контролирующим степень и продолжительность действия гормона. [c.183]

Свертывание пируваткиназы обеспечивается L-валином. Влияние аминокислоты ь-валина на ренатурацию пируваткиназы [466f дрожжей и треониндезаминазы Е. oli [468] иллюстрирует две различные функции, которые могут выполнять лиганды в процессе образования активных олигомерных белков. Пируваткиназа [467] — эго тетрамерный фермент, построенный из четырех идентичных субъединиц, каждая из которых содержит одну молекулу невалентно связанного L-валина. Субъединицы диссоциируют и развертываются при действии 6 М гидрохлорида гуанидина. При выдерживании в ренатурирующей среде L-валин служит специфичным инициатором процесса повторного свертывания. Он индуцирует ренатурацию с константой скорости псевдопервого порядка по отношению к мономеру, а это означает, что L-валин влияет на свертывание мономерной формы в ее нативную конформацию и что завершающим процессом является спонтанное образование тетрамерного фермента. ь-Валин остается составной частью всей структуры молекулы Нативного белка [466]. [c.191]

Разрушенная двуспиральная структура в определенных условиях может быть восстановлена, по крайней мере частично. Этот процесс называют ренатурацией. Ренатурация происходит, если раствор денатурированной ДНК выдерживать определенное время в условиях, когда двуспиральиая структура стабильна. Скорость ренатурации зависит от многих факторов, и в пер ю очередь от так называемой сложности ДНК, которая представляет собой число нуклеотидных пар в неповторяющихся последовательностях ДНК. Для ДНК вирусов и бактерий сложность ДНК равна числу нуклеотидных пар в геноме, поскольку в этом случае ДНК ие содержит повторяющихся последовательностей достаточно большой длины. Чем выше сложность ДНК, тем медленнее идет ренатурация. Е и ренатурации подвергают не целые, а фрагментированные молекулы, то скорость ренатурации возрастает с увеличением длины фрагментов. [c.342]

Эта работа служит примером удачного сочетания двух принципов разделения полинуклеотидов по нуклеотидному составу и размеру молекул на МАК и в зависимости от скорости ренатурации при повыщенной температуре на гидроксиапатите. [c.90]

Конечным итогом денатурации при действии температуры, кислоты или щелочи может быть разделение цепей двухспиральной молекулы 3, Это следует из очень медленного восстановления свойств, характерных для исходной (нативной) ДНК, в процессе ренатурацин (см. ниже) после достаточно продолжительного инкубирования ДНК в условиях денатурации. С этим согласуется, кроме того, второй порядок скорости реакции ренатурации, данные электронной микроскопии з а также изменение гидродинамических характеристик молекулы при денатурации °з, збо Однако наиболее убедительным доказательством, по-видимому, является возможность разделения комплементарных цепей после денатурации 109. 185-195 [c.267]

Сопоставление наблюдаемых констант скорости ренатурации для денатурированных ДНК разного происхолсдения приводится в табл. 4.13. Общее выражение для константы скорости второго порядка, таким образом, дается формулой [c.276]

Скорость ренатурации зависит от нуклеотидного состава ДНК, она несколько увеличивается при увеличении содержания пар гуанин цитозин 184, збб Если исходная нативная ДНК содержит повторяющиеся последовательности, то при ее деградации до фрагментов, примерно соответствующих длине такой последовательности, концентрация подобных фрагментов превышает концентрацию каждого из фрагментов с уникальной последовательностью во столько раз, сколько раз повторяющаяся последовательность пред-ставлена в ДНК. В связи с этим ренатурация денатурированных ДНК высших организмов носит сложный характер и включает быстрые стадии, когда происходит ренатурация более многочислен- [c.276]

В этой связи необходимо отметить, что ДНК в растворах представляет собой не статическую, раз навсегда закрепленную структуру, а динамическую, непрерывно испытывающую локальные денатурации и ренатурации Этим, по-видимому, и объясняется возможность протекания ряда химических реакций с группами оснований, расположенными внутри упаковки двойной спирали. В частности, это относится к обмену протонов ДНК, принимающих участие в образовании водородных связей, на дейтерий и тритий 28. =4i а также к реакции с формальдегидом Вероятность локальной денатурации и, следовательно, скорость химической реакции уменьшаются с увеличением степени кооперативности двухспиральнон лголекулы. [c.282]

Скорость реакции формальдегида с полинуклеотидами в большой степени зависит от вторичной структуры полимера реакция очень сильно замедляется или практически не протекает с двухцепочечными комплексами полинуклеотидов, стабилизованными водородными связями Ч Поэтому обработка формальдегидом широко используется в исследованиях вторичной структуры полинуклеотидов (см. гл. 4). Эта реакция была применена для изучения вторичной структуры полиадениловой и полицитидиловой кислот, а также для определения размеров и стабильности двухспиральных участков (см. также Денатурированная ДНК быстро реагирует с формальдегидом, причем продукт реакции теряет способность к ренатурации 4. Нативная ДНК, напротив, реагирует с формальдегидом крайне медленно анализ кинетики реакции показывает, что реакция начинается на дефектном участке двухспиральной структуры и концентрацию таких участков можно определить . Частичную денатурацию ДНК по специфическим участкам при действии формальдегида можно наблюдать под электронным микроскопом Модификация полинуклеотидов формальдегидом была применена и для некоторых функциональных исследований, в частности для изучения инактивации тРНК и для исследования изменения кодирующей способности полиадениловой кислоты в бесклеточной системе [c.412]

Рис. 86. Скорость ренатурации ДНК по восстановлению трансформируюш,ей активности (стрептомицин-устойчивость) как функция температуры отжига . (Концентрация ДНК

Температуру гибридизации подбирают для каждого эксперимента однако можно сформулировать следуюгцне основные правила. 1. Если РНК обладает отчетливо выраженной вторичной структурой (нанример, транспортная РНК), температура гибридизации должна быть выше температуры плавления этой РНК. 2. Нри продолжительной гибридизации темнература должна быть такой, чтобы скорость образования гибридов превышала скорость тепловой деградации РНК. Для РНК со слабо выраженной вторичной структурой эта температура равна 55°. 3. Когда гибридизацию проводят в растворе с относительно большими количествами ДНК, температуру следует понизить, чтобы подавить конкурентный процесс ренатурации ДНК. 4. Для РНК с низким молекулярным весом (менее 50 нуклеотидов) температура гибридизации также должна быть низкой (это необходимо для стабилизации структуры гибридов). [c.148]

Мармур так объяснил разницу в способности к ренатурации различных типов ДНК поскольку восстановление структуры двойной спирали зависит от столкновения в свободном растворе двух полинуклеотидных цепей с комплементарной последовательностью оснований, ясно, что-скорость ренатурации увеличивается с увеличением вероятности столкновения отдельных полинуклеотидных цепей с комплементарными последовательностями. Из трех типов ДНК, рассматриваемых здесь, наиболее высокую вероятность имеет ДНК бактериофага. Это объясняется следующими причинами ДНК одной фаговой частицы содержит две комплементарные последовательности оснований, каждая из которых состоит [c.181]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология