Кривые ренатурации ДНК

Важность уравнения (5) демонстрируется рисунком 9.3, на котором представлены кривые ренатурации фрагментов ДНК, полученных из молекул ДНК различной сложности. [c.265]

Интерпретация двухфазных кинетических кривых ренатурации [c.228]

Пусть размер генома составляет 3-10 пар оснований. Постройте примерные кинетические кривые ренатурации, которые должны наблюдаться для фрагментов ДНК длиной по 60 пар оснований, 300, 600 и 1800 пар. [c.381]

На рис. 107, б представлен лишь один из вариантов выявляемых кривых реассоциации ДНК эукариот, которые могут существенно различаться даже у близкородственных видов. Подобные результаты, полученные для геномов самых разных представителей эукариот, привели к заключению, что существенная часть генома (15—40 % или более, имеются значительные вариации для разных организмов) состоит из повторяющихся в разной степени последовательностей ДНК. Различают уникальные, умеренно повторяющиеся и высокоповторяющиеся последовательности ДНК эукариот, соответствующие трем выявляемым при ренатурации фракциям. Деление фракций на умеренно и высоко повторяющиеся достаточно условно. Гибридизационные методы дают достаточно грубую валовую характеристику генома в целом. Оценки числа копий генов, проведенные гибридизационными методами, не всегда давали правильные результаты вследствие ряда артефактов, сопровождающих эти эксперименты. [c.188]

Отметим, что в отличие от кривых титрования ДНК кривые титрования синтетических полинуклеотидов оказываются обратимыми. Это обусловлено восстановлением двойных спиралей при уменьшении электростатического взаимодействия. В ДНК из-за гетерогенности структуры ренатурация неполная, что приводит к несовпадению кривых прямого и обратного титрования. [c.32]

При этой концентрации снята кривая рис. 86, на которой скорость ренатурации (вернее, глубина ренатурации, достигаемая в течение 1 часа отжига) отложена как функция температуры отжига. Опыты в этом случае ставились так же, как в эксперименте, изображенном на рис. 83, т. е. ДНК нагревалась, быстро охлаждалась, причем денатурированное состояние фиксировалось, а затем она отжигалась при постоянной температуре в течение [c.269]

Рис. 111.3. Кривые реакции денатурации и ренатурации лизоцима (в) и цитохрома с (5) в 2,5 М растворе гуанидингидрохлорида, 25°, pH 2,6 (в) и 6,5 (б)

На практике при изучении ренатурации ДНК эукариот обычно наблюдаются кинетические кривые нескольких типов. Типичные экспериментальные данные такого рода представлены на рис. 23.21. Небольшая доля ДНК ренатурирует столь быстро, что соответствующую часть кинетической кривой проследить не удается. Эта часть материала имеет очень низкую кинетическую сложность (Х < 60) и должна соответствовать простым повторяющимся последовательностям типа сателлитной ДНК. Сюда следует также отнести палиндромные последовательности, в которых всегда может происходить внутримолекулярная ренатурация с образованием шпилек. Затем имеется большой класс последо- [c.350]

Кинетика гибридизации второго порядка нескольких очишенных гомогенных препаратов ДНК представлена на рис. 7.27. Как и во многих эю пери-ментах по гибридизации, ДНК перед денатурацией и реассоциацией была разрезана на фрагменты длиной около 400 пар оснований. Обратите внимание на то, что шкала ot логарифмическая это облегчает сравнительный анализ данных. Соответствие кинетических кривых простой реакции второго порядка следует из того, что ренатурация на 90% укладывается в интервал значений ot, охватывающий два порядка величины. [c.340]

На рис. 83 представлены кривые ренатурации разных видов ДНК. Опыт ставился так двойные спирали расплавлялись, и затем денатурированное состояние замораживалось путем быстрого охлаждения. Затем температура быстро поднималась до 67° — температуры, лежащей несколько ниже точек перехода. При 67° происходил постепенно обратный переход в нативпую [c.267]

Зависимость концентрации одноцепочечной ДНК от времени в процессе реакции ренатурации описывается гиперболической функцией (вывод формулы приводится в дополнении 9.1). График зависимости концентрации от времени при fej = 1 изображен на рис. 9.2. С помощью этого уравнения по времени необходимому для ренатурации половины исходного количества ДНК ( / q = 0,5), можно определять показатель реакции ренатурации ( oii/2)- Эта величина прямо пропорциональна числу нуклеотидов в неповторяющейся последовательности ДНК. Эта закономерность иллюстрируется на рис. 9.3 для нуклеиновых кислот, полученных из различных объектов. Другими словами, мы можем определить общий объем уникальной генетической информации, кодируемой ДНК, измеряя значение t i2 Более того, экспериментально определяя кривые ренатурации ДНК, мы можем установить присутствие в геноме повторяющейся генетической информации. [c.262]

ПОЧТИ тождественна теоретической кривой, представленной на рис. 9.2. Так как теоретическая кривая получена на основе предположения о том, что скорость реакции второго порядка / j неизменна, это означает, что ренатурация фрагментированной ДНК Е. соИ характеризуется определенным значением kj. Что касается ДНК теленка, то, напротив, некоторые фрагменты ренатурируют со скоростью, много большей скорости ренатурации фрагментированной ДНК Е. oli, тогда как остальная ДНК (около 60%) ренатурирует много медленнее. На основе этих наблюдений можно заключить, что геном эукариот (в данном случае геном теленка) содержит как нуклеотидные последовательности, представленные в геноме лишь в единственном экземпляре, так и различные нуклеотидные последовательности, каждая из которых многократно повторена в геноме. Так, например, основываясь на кривой ренатурации, можно показать, что геном мыши содержит сложный набор нуклеотидных последовательностей, частота представленности которых в геноме схематически изображена на рис. 9.5. [c.264]

На рис. 9.4 сравниваются кривые ренатурации бактериальной ДНК и ДНК эукариотических организмов. По форме кривой видно, что ренатурация бактериальной ДНК происходит при неизменном значении константы скорости реакции второго порядка, т. е. в соответствии с уравнением (2). Напротив, кривая ренатурации ДНК эукариотического организма свидетельствует о том, что в процессе ренатурации величина 2 должна изменяться. Для того, чтобы интерпретиро- [c.266]

Рис. 3. Кривые ренатурации ДНК мыши и ДНК из Е. соИ Фрагменты денатурированной ДНК размером 400 п н. отжигали при разных величинах Со/ и определяли количество ренатурированной ДНК с помощью хроматографии на гидроксилапатите. ДНК Е. oli денатурирует в узком интервале oi, будучи представлена только уникальными последовательностями, ДНК мыши распадается на несколько кинетических компонентов (по результатам, полученным Дж. Хирстом).

Корреляция двух кривых перехода (рис. 8-22) является дополнительным доказательством того, что упорядоченные водородные связи в ДНК существуют лишь в ее спиральной структуре, так как изменение оптического вращения отражает конформационные переходы и непосредственно не связано с количеством водородных связей в молекуле ДНК- Можно предположить, что образование водородных связей между основаниями практически не оказывает прямого влияния на удельное вращение, хотя оптическая активность мононуклеотидов зависит от природы оснований. Аналогичное совпадение в изменении оптической плотности и удельного вращения (от +300° до +25°) наблюдалось при нагревании двухцепочечного полиаденилил-полиуридилового комплекса, что указывает на прямую связь между разрывом водородных связей и переходом спираль — клубок [238]. Оказалось, что при ренатурации денатуриро- [c.582]

Реассоциацию ДНК обычно изображают в виде кривой gi, где значениям log t соответствует процентное содержание в смеси фракции реассоциировавшей ДНК (1 - С/Со). На рис. 17.2 приведены кривые t для нескольких геномов. Форма кривых одинакова, ренатурация осуществляется в диапазоне изменения значений gi [c.224]

Рис. 9.4. Сравнение кинетики реассоциации фрагментов ДНК Е. соИ и фрагментов ДНК теленка. Форма графика для ДНК Е. oli очень близка к теоретической кривой, представленной на рис. 9.2, что указывает на то, что ренатурация ДНК происходит при единственном неизменном значении константы скорости реакции f j- Напротив, график кине-

Относительно быстрая реставрация структуры ферментов по сравнению с медленным восстановлением их биологической активности показывает, что промежуточные конформационные состояния образуются в заметных концентрациях. Тот факт, что полученные на разных стадиях ренатурации спектры ДОВ и спектры флуоресценции не имеют изосбестической точки, совпадающей с пересечением спектральных кривых состояний N и О, свидетельствует о том, что все промежуточные состояния одновременно присутствуют в растворе и находятся в равновесии. Условия окружения, а именно наличие или отсутствие специфических субстратов или кофакторов, их концентрация, значения pH раствора, ионной силы и концентрация белка, существенно влияют на скорость пространственной организации молекулы и на ее биологическую активность. Анализ полученных данных привел авторов к выводу, что свертывание фумаразы, энолазы и альдолазы определяется прежде всего термодинамическими факторами, а у трех других белков существенно влияние также кинетических факторов. У предста- [c.354]

На рис. III.7 приведены денситометрические кривые электрофоретического разделения молекул БПТИ, блокированных йодацетамидом (я) и йодацетатом (б) в процессе медленной ренатурации. Сначала весь блок находился в состоянии D, которому отвечает в обоих случаях единственный резкий максимум плотности. При ренатурации и гашении реакции тиол-дисульфидного обмена через 1, 3. [c.366]

Рис. П1.7. Денситометрические кривые электрофоретического разделения молекул, фиксированных йодацетамидома (а) и йодацетатом (6) в процессе ренатурации восстановленного белка БПТИ [59]

Рис. ШЛО. Денситометрические кривые электрофоретического разделения молекул, фиксированных йодацетамидом (а) и йодацетатом (б) в процессе ренатурации панкреатической рибонуклеазы с использованием в качестве дисульфидного реагента дитиотреитола [83]

С. Шаффер [87], исследуя процесс ренатурации рибонуклеазы с помощью 8-8-глутатиона, обнаружил, что образование моно- и ди-8-З продуктов практически не сказывается на кривых кругового дихроизма, при последующем появлении и накоплении продуктов с большим числом дисульфидных связей они приближаются к спектру нативного белка. В связи с тем, что в данном случае изменения в спектрах кругового дихроизма, как и в случае изменений поглощения и флуоресценции, отмеченных Р. Хантгеном и соавт. [81], происходили раньше восстановления ферментативной активности рибонуклеазы, то, как полагает Крейтон, они связаны главным образом с формированием у три- и тетра-8-8-производных вторичных структур и гидрофобного окружения у ароматических остатков, а не с завершением образования нативной конформации. С. Шаффер и соавт. [88] исследовали влияние среды на скорость свертывания белковой цепи рибонуклеазы с использованием окисленного и восстановленного глутатиона. Обнаружено, что действие нейтральных солей на скорость ренатурации [c.377]

Для раскрытия пути ренатурации и побудительных мотивов процесса требуется прежде всего идентифицировать промежуточные состояния белковой цепи (I), посредством которых реализуется реакция перехода развернутого состояния (D) в свернутое (N). Согласно общепринятой трактовке явления данатурации как равновесного, обратимого процесса, состояния I находятся на кривой изменения свободной энергии вдоль координаты реакции в энергетических минимумах, разделенных потенциальными барьерами, отвечающими переходным состояниям (TS). Как правило, промежуточные соединения I термодинамически неустойчивы. Они могут быть обнаружены лишь кинетически, причем в том случае, если их образование предшествует скорость-лимитирующей стадии, а свободная энергия совпадает или ниже энергии состояния D. Рис. III. 15 иллюстрирует три возможных варианта протекания простейшей реакции свертывания [c.388]

Три класса ДНК хорошо выявляются на кривых ее ренатурации (рис.З), если откладывать на оси абсцисс логарифмы Со/, т. е. произведения концентрации ДНК (моль Р/л) на время (с), а по оси ординат — процент ре-натурированной ДНК. Например, у млекопитающих около 15 % ДНК ренатурирует в интервале oi от 10 до 10 (сателлитная ДНК), еще 10—20 % — в интервале Со/ от 10 до 10 (умеренные повторы) и остальные 70 % (уникальная ДНК) — в интервале от 10 до 10 , [c.22]

Проведем теперь тот же самый эксперимент с ДНК коровы. Ее геном (3-10 пар нуклеотидов) превратится в 7 500 000 двухцепочечных фрагментов ДНК, а после нагревания — в 15 ООО ООО одноцепочечных. Если каждый фрагмент представлен единственной копией, то кривая реассоциации должна быть похожа на кривую, которая получается в опыте с фрагментами ДНК Е. oli. Но это не так (рис. 15-1, справа). Значит, некоторые фрагменты присутствуют во мпогих копиях. Их комплементарные цепи встречаются очень часто, и ренатурация идет очень быстро. Другие фрагменты представлены меньшим числом копий, их реассоциация идет медленнее, чем в первой группе, но все еще достаточно быстро. Эти повторяющиеся фрагменты составляют приблизительно 40% всей ДНК коровы Оставшиеся 60% фрагментов, вероятно, уникальны, и их реассоциация идет со скоростью, сравнимой со скоростью реассоциации фрагментов ДНК Е. соИ. [c.264]

РИС. 23.21. Кинетика ренатурации ДНК Е. oli (сплошная кривая) и ДНК из тимуса теленка (пунктирная кривая). В последнем препарате можно выделить три класса последовательностей уникальные, для которых Сд t — 1(Я последовательности со средней кратностью повторов, Ср i = 10 небольшие последовательности с высокой кратностью повторов и палиндромные последовательности, q i < 10 . Наличие повторов и приводит к тому, что часть ДНК из тимуса теленка ренатурирует быстрее, чем ДНК Е. соИ, хотя у последней размер генома значительно меньше. (Britten R. J., Kohne D. Е., [c.351]

А — зависимость Огбо ДНК от температуры в условиях высокой ионной силы. После достижения ЮО С температуру понизили до 20Х. Огео падает, как показано до величины 1,12. Б— ДНК, которая была нагрета до ЮОХ и охлаждена до 20°С, нагрели снова и получили кривую зависимости Огео от температуры изменение О теперь происходит в более широком интервале температур. В —ДНК, которую использовали в части Б, нагревали до 88°С и охлаждали в течение указанных промежутков времеии. Уменьшение Лгео указывает на образование все более совершенного дуплекса (ренатурацию). [c.526]

А. Денатурация (диссоциация) двухцепочечной ДНК при повышении температуры раствора и ренатурация (реассоциация) двух комплементарных цепей при охлаждении, Б. Кривые денатурации типичной двухцепочечной ДНК, получаемые при повышении температуры и pH. и рН - это значения температуры и pH соответственно, при которых ДНК денатурирована (или ренатурирова-на) наполовину. [c.47]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология