ДНФ-аминокислот, автоматизированная определение

Ионообменная хроматография аминокислот на колонках. Определить аминокислотный состав белка — значит установить массовое или молярное соотношение составляющих его аминокислот, для чего необходимо точно определить количество последних. Само по себе количественное определение аминокислот особых затруднений не представляет, так как для этой цели имеется несколько приемлемых способов. Основное препятствие состоит в разделении их смесей, чего, однако, избежать нельзя, поскольку пока нет методов, позволяющих определять аминокислотный состав белков без гидролиза. Поэтому полипептидные цепи белков сначала расщепляют с помощью кислот или щелочей и определяют аминокислоты в полученных смесях. ИОХ по существу представляет собой метод разделения весьма сходных по химическим и мало различающихся по физико-химическим свойствам аминокислот. В настоящее время ИОХ достигла высокой точности, составляющей 2—4% (относительных). Механизация аналитического процесса привела к созданию так называемых аминокислотных анализаторов, которые, постепенно совершенствуясь, стали полностью автоматизированными быстродействующими агрегатами, работающими по заданной программе. Разделение аминокислот, как правило, ведется на катионитах, из которых чаще всего используется сульфированный полистирол, сшитый дивинилбензолом, добавляемым при синтезе в количестве 8%. [c.189]

ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА белка, последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи. В П. с., закодированной в соответствующем данному белку структурном гене, заложено все необходимое для ее самоорганизации в глобулу с определенной пространств, структурой. П. с. определяет вторичную и третичную структуры белка. Методы ее установления хорошо разработаны полипептидную цепь специфически расщепляют протеиназами (трин-сином — по остаткам аргинина и лизина, химотрипсином — по остаткам аром, аминокислот и лейцина) или хим. методами (бромцианом по остаткам метионина) в полученном наборе перекрывающихся пептидных фрагментов определяют последовательность аминокислот, используя преим. ступенчатое расщепление по Эдману (процесс автоматизирован), и сопоставляют строение фрагментов. [c.429]

Наиболее общим методом определения концентрации пептидов является колориметрия продуктов реакции с нингидрином [2]. Это один из наиболее чувствительных колориметрических методов. Для обнаружения аминокислот и пептидов разработаны как обычный, так и полностью автоматизированный варианты, причем нингидриновый реагент не вызывает коррозии и его можно подавать обычным микронасосом. Реакция идет по свободным аминогруппам, но в некоторых случаях хромофор образуется с низким выходом. Данные по окрашиванию дипептидов можно найти в работе [3]. У всех дипептидов, содержащих в качестве Ы-концевой аминокислоты аргинин, треонин, серин, глутаминовую кислоту, глицин, фенилаланин, метионин, лейцин и тирозин, интенсивность окраски составляет 1,6-10 у лейцина эта величина составляет 1,7-10 . У дипептидов с М-концевым лизином и аспарагиновой кислотой интенсивность окраски несколько выше (на 20 и 29% соответственно), а дипептиды с Ы-концевым гистидином и триптофаном проявляются несколько слабее (42 и 67% соответственно от средней интенсивности). Дипептиды с М-концевым пролином, валином и изолейцином окрашиваются очень слабо [2,7 6,4 и 8,5% от средней (1,6- 10 ) интенсивности]. [c.391]

Все реакции протекают в пленке раствора, которая покрывает стенки вращающейся цилиндрической камеры. Это облегчает экстракцию и последующее удаление растворителей. Несколько фирм выпускают приборы, позволяющие проводить полностью автоматизированное определение последовательности полипептидов, содержащих до 30—40 остатков (в некоторых случаях до 60 или даже до 80 остатков) за один прогон. В прибор заложена программа последовательного отщепления -по Эдману N-концевых остатков полипептида. После отщепления, выделения и идентификации исходной N-концевой аминокислоты (рис. 4.11) образуется эдмановское производное следующей аминокислоты и т. д. Идентификацию фенилтиогидантоиновых производных производят с помощью жидкостной хроматографии под давлением. На таком приборе можно определить последовательность значительно более длинных участков, чем при секвенировании вручную, причем гораздо быстрее. [c.39]

За последнее десятилетие возможности применения рентгеновского анализа значительно возросли. Около десяти лет тому назад была закончена работа Ходжкин с сотрудниками по бензилпени-циллину это был один из первых примеров использования данного физического метода для решения трудной стереохимической проблемы. К 1956 г. в той же лаборатории было установлено строение витамина В12, а в настоящее время с помощью рентгеновского анализа Кендрью с сотрудниками определяют последовательность соединения аминокислот в глобулярном протеине — миоглобине. За то же время стандартное отклонение при определении этим методом длин связей в сравнительно простых молекулах было уменьшено в десять раз — до нескольких тысячных ангстрема. Огромную пользу принесло развитие вычислительной техники вероятно, что с развитием полностью автоматизированных методов измерений будут вскоре преодолены и другие препятствия. Тем не менее, определение кристаллической структуры останется, вероятно, длительным процессом, требующим в сложных случаях до десяти и более лет работы в расчете на одного человека. [c.176]

Что касается скорости, чувствительности и стоимости, любой из газохроматографических методов выгодно отличается от существующих автоматических анализаторов на смоле, но последние удобнее и проще в обращении. Более широкое использование ГХ будет зависеть главным образом от развития автоматизированных методов. Нетрудно представить себе прибор с помещенным в нем рядом образцов пептидов или белков, которые обрабатываются по очереди определенными реагентами и затем по одному подаются на хроматографическую колонку в ходе элюирования пики идентифицируются, интегрируются, а результаты печатаются в виде количества наномолей аминокислоты. Сароф (личное сообщение) уже работает в этом направлении, используя газофазное получение производных. Реагенты для приготовления ТФА-метиловых эфиров проходят вместе с газом-носителем над образцом, который затем упаривают в токе горячего газа и подают на колонку. Следует отметить, что при метилировании раствором НС1 в метаноле может протекать алкоголиз пептидов и белков, что позволяет обойтись без длительной и утомительной стадии гидролиза [11]. Сароф также снизил время элюирования менее летучих аминокислот и отказался от программирования температуры, применив колонку из трех секций с уменьшающейся температурой, каждая секция работает в изотермическом режиме [84]. С помощью кранов между секциями аминокислоты направляются или на следующую секцию, или же непосредственно в детектор. Этот метод должен облегчить автоматизацию, ускорить разделение и значительно увеличить срок службы колонки. [c.132]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология