Нингидриновый реагент

Для анализа по двухколоночной схеме нингидриновый реагент готовят следующим образом [4] [c.338]

ПРИГОТОВЛЕНИЕ КАДМИЙ-НИНГИДРИНОВОГО РЕАГЕНТА [c.248]

I, 2 — насосы для подачи буферных растворов 3 — насос для подачи нингидринового реагента 4, 5 — длинные колонки в, 7 — короткие колонки 8 — автоматический кран для переключения буферов 9 — реактор (тефлоновый капилляр, длиной 30 м с внутренним диаметром 0,7 мм, в кипящей водяной бане) /А — колориметр с тремя кюветами (570, 440 и 570 нм с пониженной чувствительностью) /7 — трехканальный самописец /2 —ротаметр 13 — ультратермостат. [c.318]

ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОЛЛИДИН-НИНГИДРИНОВОГО РЕАГЕНТА [c.249]

Рис. 32.4. Автоматическая пипетка с сосудом для нингидринового реагента.

Наиболее общим методом определения концентрации пептидов является колориметрия продуктов реакции с нингидрином [2]. Это один из наиболее чувствительных колориметрических методов. Для обнаружения аминокислот и пептидов разработаны как обычный, так и полностью автоматизированный варианты, причем нингидриновый реагент не вызывает коррозии и его можно подавать обычным микронасосом. Реакция идет по свободным аминогруппам, но в некоторых случаях хромофор образуется с низким выходом. Данные по окрашиванию дипептидов можно найти в работе [3]. У всех дипептидов, содержащих в качестве Ы-концевой аминокислоты аргинин, треонин, серин, глутаминовую кислоту, глицин, фенилаланин, метионин, лейцин и тирозин, интенсивность окраски составляет 1,6-10 у лейцина эта величина составляет 1,7-10 . У дипептидов с М-концевым лизином и аспарагиновой кислотой интенсивность окраски несколько выше (на 20 и 29% соответственно), а дипептиды с Ы-концевым гистидином и триптофаном проявляются несколько слабее (42 и 67% соответственно от средней интенсивности). Дипептиды с М-концевым пролином, валином и изолейцином окрашиваются очень слабо [2,7 6,4 и 8,5% от средней (1,6- 10 ) интенсивности]. [c.391]

Анализ белковых гидролизатов проводят следующим образом. Утром включают анализатор, нагревают до рабочей температуры термостат и баню реактора, готовят буферные растворы и реагенты. Образец растворяют в 0,2 н. буферном растворе цитрата натрия с pH 2,2 и аликвотную часть в 2 мл полученного раствора вводят в короткую колонку. При этом вначале удаляют из колонки избыток буферного раствора, а затем пипеткой с тонким концом осторожно (по стенке) вводят раствор образца. Впитывание образца проводят при избыточном давлении газа (азот или воздух) 0,3 атм. Стенки колонки ополаскивают тремя порциями по 0,5 мл 0,2 н. буферного раствора цитрата натрия, заполняют элюирующим буфером верхнюю часть колонки, плотно закрывают, включают микронасос и реле времени. По установлении рабочего давления определяют скорость потока в системе. Через час включают насос подачи нингидринового реагента. К этому времени все кислые и нейтральные аминокислоты уже элюированы из колонки. После установления рабочего давления определяют скорость потока и включают самописец. Анализ основных аминокислот заканчивается через 5 ч. После запуска короткой колонки вторую половину раствора образца (в 2 мл буфера) вводят в колонку длиной 150 см. По окончании анализа основных аминокислот включают подачу элюента на длинную колонку (150 см). Одновременно включают реле отсчета времени анализа, реле смены буфера (установленное на 8 ч 20 мин) и реле окончания [c.319]

В процессе развития аминокислотного анализа состав нингидринового реагента неоднократно подвергался изменениям, однако основные принципы, заложенные в первых работах Мура и Стайна [10, 33], остались неизменными. Основу буфера составляет концентрированный раствор ацетата натрия с pH 5,0, что является оптимальным для полноты реакции и измерения поглощения. Водный раствор метилцеллозольва обеспечивает хорошую растворимость как органических соединений, так и неорганических солей. Восстановленный нингидрин, необходимый для запуска реакции, получают под действием хлорида олова (И). Реагент готовят и хранят в отсутствие кислорода воздуха, например в атмосфере азота. [c.338]

Работы, в которых приведено описание модификаций нингидринового реагента, можно разделить на две группы. Ряд модификаций рассматривался еще в 50-е годы, в результате чего были заменены некоторые растворители [34]. Несмотря на то, что это привело к усилению интенсивности окрашивания, метод оказался непригодным для рутинных анализов большого числа образцов. Вторая группа работ посвящена поиску более приемлемого восстанавливающего агента, чем хлорид олова (П). В качестве восстановителей были предложены аскорбиновая кислота, цианид калия, дитионит натрия, хлорид титана (П1) предлагают даже использовать электролитическое восстановление. Однако ни один из этих методов практически не нашел применения. [c.339]

К свободному или иммобилизованному ферменту в 1 мл воды или разбавленного 0,02 М буфера добавляют по 1 мл нингидринового реагента (250 мг нингидрина в смеси 6 мл 90%-ной муравьиной кислоты и 4 мл конц. НС1). Приготовленные таким образом смеси в закрытых колпачками пробирках инкубируют в водяной бане при 100 °С в течение 20 мин, охлаждают и отбирают из каждой пробирки по 1 мл пробы разбавляют 9 мл 95%-ного спирта. [c.249]

Имеется в виду неточный перенос пробы в колонку, изменение моляр-ности и pH буферов и нингидринового реагента, а также любая ремонтная операция, проводимая с анализатором после калибровочного анализа. — Прим. перев. [c.49]

В ходе анализа через эту трубку отбирают нингидриновый реагент. Прим, перев. [c.54]

Для получения проявителя смешивают 100 мл раствора I и 20 мл раствора 2. Кадмий-нингидриновый реагент дает стабильную красную окраску со всеми аминокислотами (кроме Про, который в первые минуты проявления желтеет, а через несколько минут обесцвечивается). При одномерном разделении 16 аминокислот для достоверного отличия Гли от Ала, имеющих близкие значения Яр целесообразно применять коллидиновый раствор нингидрина, [c.248]

При быстрой идентификации и качественной оценке хорошо высушенную в потоке теплого воздуха пластинку осторожно и равномерно опрыскивают выбранным нингидриновым реагентом. После опрыскивания слой высушивают феном. В течение 2—3 мин развивается окрашивание и проявляются пятна. [c.249]

Обработку фракций проводят в штативах, рассчитанных на 50 пробирок. В каждый штатив помещают также пробирки со стандартными и контрольным растворами. К 2 мл анализируемого раствора автоматической пипеткой добавляют 1 мл нингидринового реагента и тщательно перемешивают. Затем штатив с пробирками помещают на 20 мин в кипящую водяную баню (100°С) и охлаждают в бане с проточной водой в течение 5 мий. Автоматической пипеткой в каждую пробирку вводят по 5 мл 60%-ного этанола и тщательно перемешивают пробирки выдерживают при комнатной температуре 1 ч, в течение которого в результате окисления кислородом воздуха исчезает красная окраска гидридантина. Наконец, определяют оптическую плотность при 570 нм, а фракции, содержащие пролин и оксипролин, анализируют при 440 нм. В качестве контроля (фона) используют среднюю величину оптической плотности, полученную при аналогичной обработке фракций, не содержащих аминокислот. Важно в процессе измерения проводить сравнение с контрольным раствором, содержащим буфер аналогичного состава. При градиентном элюировании наблюдается постепенное увеличение фона вследствие накопления в буфере нингидринположительных примесей. В этом случае в качестве контрольного раствора еле- [c.314]

В качестве исходных данных для конструкции реактора послужили условия реакции аминокислот с нингидриновым реагентом и скорость элюирования. Скорость подачи реагента (15 мл/ч) определяется скоростью подачи элюата (30 мл/ч) и соотношением объемов элюата и реагента (2 1). Суммарная скорость потока (45 мл/ч) и время инкубации смеси при 100 °С (15 мин) позволяют рассчитать объем реактора (равный 11,5 мл). Однако при таком объеме реактора неизбежно должно наступить смешивание зон, если использовать трубку слишком большого диаметра. Опытным путем было показано, что перекрывание зон наступает лишь при внутреннем диаметре более 1 мм. Поэтому спираль реактора представляет собой тонкий тефлоновый капилляр с внутренним диаметром 0,7 мм и длиной 30 м. Электрические нагревательные элементы термостата обеспечивают равномерное кипение воды, а конденсация паров осуществляется в обратном воздушном холодильнике. [c.317]

Уже в первых моделях анализаторов для обеспечения нормальной эксплуатации были автоматизированы две операции — смена элюента и выключение прибора. Смена элюента осуществлялась при помощи электромагнитного клапана, соединенного с реле времени. В анализаторах с одноколоночной схемой подключение к смесителю Varigrad производилось вручную, поскольку эта операция соответствовала началу анализа. Выключение прибора осуществлялось вторым реле. По истечении времени анализа реле вначале отключало насос, подающий нингидриновый реагент, и самописец. Спустя 30 мин, т. е. после удаления из системы остатка нингидринового реагента, реле выключало насос, подающий элюент. [c.319]

Одноколоночный анализ белковых гидролизатов и физиологических жидкостей проводят по единой схеме на колонке 0,9 X Х133 см при 60 °С. Смолу урановешивают 0,25 н. буферным раствором цитата натрия с pH 2,91. Образец вносят в 2 мл буферного раствора с pH 2,0. Первый буферный раствор (0,25 и. с pH 2,91), подают микронасосом со скоростью 30 мл/ч. После установления рабочего давления включают самописец, определяют скорость подачи и включают насос подачи нингидринового реагента, установленный на 30 мл/ч. Поскольку элюирование ведут в градиенте буфера, используют нингидриновый реагент с большей буферной емкостью. Градиент формируют [c.320]

В смесителе Varigrad, сосуды которого заполнены в соответствии с данными табл. 32.1. Примерно через 20 мин после включения подачи нингидринового реагента устанавливают базовую линию при 570 нм на уровень 0,020 при 570 нм для второго фотометра—на уровень 0,000 при 440 нм — на уровень 0,050 ед. оптической плотности. [c.321]

С пористым стеклянным фильтром, сферическими шлифами и сменным наружным кожухом. Элюат из хроматографической колонки через ротаметр пузырькового типа поступает в делитель потока, а затем в соответствующий канал пропорционирующего насоса, который одновременно подает нингидриновый реагент и поток азота. Скорость подачи перистальтического насоса установлена ниже скорости элюата из хроматографической колонки с тем, чтобы предотвратить попадание в систему воздуха. Од- [c.322]

Элюат и нингидриновый реагент подаются с равной скоростью и смешиваются в соотношении 1 1. Немедленно после смешивания поток рассекается пузырьками азота на небольшие отрезки для предупреждения расширения зон в системе детектирования. Дальнейшее перемешивание (уже в пределах каждого отрезка) происходит в спирали смесителя и реактора (100°С), в котором раствор находится в течение 15 мин и где развивается окраска. Затем смесь проходит через деаэратор, откуда аликвотная часть раствс>ра подается перистальтическим насосом по узкому шлангу (с внутренним диаметром 0,5 мм) в проточ- [c.322]

В обычном аминокислотном анализаторе N -2 сохранен блочный принцип. Прибор снабжают одной или несколькими колонками (0,5X75 см). Анализ белковых гидролизатов может занять 2 ч 30 мин анализ образцов более сложного состава может длиться более 36 ч. Прибор имеет два колориметра, с полосами пропускания при 570 и 440 нм в случае необходимости можно использовать один колориметр с полосой при 410 нм. Полагают, что потерю чувствительности можно многократно перекрыть благодаря непрерывному 10-кратному расширению шкалы, что вообше является конструктивной особенностью этих колориметров. Для достижения максимального разрешения используют также рассечение потока пузырьками азота (что является характерной особенностью анализатора Te ni-соп), хотя новый состав нингидринового реагента, с использованием гидразинсульфата, делает излишним хранение его под азотом. Предел детектирования аминокислот составляет 1 нмоль. [c.325]

Нингидриновый реагент готовят в бутыли объемом 4 л, через которую тем или иным способом продувают очищенный азот. 3 л метилцеллозольва перемешивают магнитной мешалкой при продувании азотом в течение 15 мин. Добавляют 80 г нингидрина соответствующей степени чистоты и вновь перемешивают при барботировании азота в течение 15 мин. После растворения нингидрина добавляют 1 л 4 н. ацетата натрия с pH 5,5 и смесь перемешивают в атмосфере азота еще в течение 30 мин. Наконец, к раствору добавляют 1,6 г дигидрата хлорида олова (П) (хч, негидратированный). После получения прозрачного раствора прекращают подачу азота и закрывают бутыль пробкой с двумя вводами. В заключение готовый реагент передавливают азотом по тайгоновому шлангу в резервуар прибора. Предварительно продувают азотом все соединительные линии. Процедура передавливания нингидринового реагента должна занимать не более 5 мин. [c.339]

Реагенты. Состав натрийцитратных буферов приведен в табл. 2. Приготовление нингидринового реагента описано в разд. 1.6.3. [c.57]

При колориметрическом определении аминокислот во фракциях из хроматографических колонок в качестве стандартов используют. хроматографически чистые образцы отдельных аминокислот, дающих с нингидриновым реагентом окраску, близкую по интенсивности к теоретической. Такими аминокислотами являются лейцин, изолейцин и аланин. При последующих расчетах интенсивность окраски различных аминокислот выражают в так называемых лейциновых единицах. Эти данные используют для вычисления истинного содержания той или иной аминокислоты в образце. [c.342]

При автоматическом анализе элюат делят на три потока, два из которых подвергают анализу с нингидриновым реагентом, а третий подают на коллектор. Обычно для этого исполь- [c.392]

Этот метод можно применять в сочетании со шелочным гидролизом. При автоматическом анализе с использованием ТНБС шланги не забиваются, как в случае с нингидриновым реагентом [11]. [c.394]

Колонка 0,9X69 см. Ионит смола РА-28. Буферные растворы / — 0,2 М натрийцитратный буфер pH 3,05 II — 0,2 М натрийцитратный буфер, pH 4,25. Скорость подачи буферов и нингидринового реагента 34 мл/ч. Температура 56 С. Переключение буферных растворов через 230 мин. Детектирование определение поглощения при 570 и 440 нм. Порядок выхода и времена удерживания (мин) У — L-оксипролин, 110 2 —L-треонин, 137 3 —саркозин, 163 4 — К-метил-0,Ь-валин, 175 5 — L-пролин, 193 6 — Н-метил-В,Ь-алло-изолей-дин. 235 6а — К-метил-0,Ь-изолейцин, 279 7 — D-валин, 320 8 — D-алло-изолейцин, 337 [c.227]

Стандартный раствор лактазы был приготовлен растворением 100 мг лиофнлизованной Р-галактозидазы в 10 мл 0,02 М фосфатного буфера (pH 7,0). Стандартный раствор глюкоамилазы был приготовлен подобным образом в 0,02 М ацетатном буфере (pH 4,0). Аликвоты разбавлялись до 1,0 мл тем же буфером и к каждому раствору добавлялось по 21,0 мг коллагеновон пленки. К пробам и контрольному раствору коллагена добавлялось по I мл нингидринового реагента и растворы инкубировали 20 мин в водяной бане при 100 °С. После охлаждения аликвоты по I мл ра.чбавлялись [c.250]

Другие модификации нингидринового реагента были описаны Муром и Стейном [11]. По одной из модификаций исключается двухлористое олово, которое добавлялось для образования гидриндантина. В этом случае используют готовый гидриндантин, чтобы предотвратить возможность выпадения солей олова. Блакбурн [34] подробно обсудил химический состав нингидринового и других реагентов на а-аминокислоты, образующих окрашенный продукт (называемый фиолетовая Руэмана), и рассмотрел различные факторы, влияющие на стабильность нингидринового реагента. [c.25]

Киршенбаум [120] использовал в качестве растворителя для нингидринового реагента смесь метилцеллозольв — диметил-сульфоксид (70 30). Для получения полностью растворимой смеси нингидрина и гидриндантина Мур [121] улучшил состав реагента, заменив метилцеллозольв ди] етилсульфоксидоЙ и [c.25]

При реакции (100 °С) нингидрин — гидриндантина и аминокислот образуется двуокись углерода [104]. При попадании пузырьков этого газа в кювету может нарушиться световой поток. Поэтому пузырьки газа, образующ,иеся в результате химической реакции или по другим причинам, должны легко и быстро удаляться. По той же причине необходимо удалять из кюветы и коллоидный осадок, образующийся из солей олова и, возможно, метилцеллозольва (см. обсуждение приготовления нингидринового реагента). Плотность таких коллоидных осадков в отличие от плотности пузырьков газа в некоторых случаях настолько высока, что поток буфера не может вымыть их из кюветы. Поэтому при конструировании кюветы всегда нужно учитывать возможность их загрязнения коллоидными осадками. [c.27]

Интенсивность окраски реакционной смеси, получающейся при добавлении нингидринового реагента к эффлюенту, измеряется проточным колориметром в условиях постоянной скорости потока жидкости. Возникающее изменение напряжения на фотоэлементе регистрируется самописцем. Обычно выходное напряжение колориметра на самописец составляет О—5 мВ. При максимальном развитии окраски (наивысшая оптическая плотность, ОП) напряжение равно нулю, а при отсутствии, за исключением фона реагентов (фоновая линия), напряжение составляет 5 мВ. Для точной записи результатов хроматографического анализа самописец должен а) точно реагировать только на сигнал фотоэлемента калориметра б) допускать длительную работу с минимальным дрейфом из-за тепловых и электрических помех в) иметь постоянную скорость лентопротяжного механизма для обеспечения точной идентификации пиков по времени. Если запись на самописце производится на диаграммной бумаге с линейной шкалой, то для расчета пиков аминокислот или пептидов необходим шаблон с нанесенной сеткой ОП. Если самописец снабжен диаграммной бумагой со шкалой в единицах ОП или логарифмической шкалой, величина поглощения находится непосредственно. Другими вспомогательными элементами, которые связаны с записью анализа и считаются составными частями системы регистрации, являются устройства, осуществляющие расширение шкалы, логарифмирование сигнала, интегрирование пика, а также цифропечать и связь с ЭВМ. Расширение шкалы представляет собой метод, по которому вся шкала самописца может быть легко заменена с О—5,0 мВ на 4,0—5,0 или 4,5— [c.32]

Обычно пептиды при реакции с нингидриновым реагентом дают слабое окрашивание, так как они реагируют только свободной аминогруппой. Если же пептид подвергнуть щелочному гидролизу, то все освобождающиеся аминокислоты будут реагировать с нингидрином, давая интенсивное окрашивание. Метод [c.38]

Приготовление нингидринового реагента. Для приготовления нингидринового реагента рекомендуется использовать стеклянную бутыль, выкращенную в черный цвет. При этом полезно оставить на бутыли узкую неокращенную вертикальную полоску щириной около 1 с м, чтобы иметь возможность наблюдать за растворением реактивов в процессе приготовления нингидринового реагента и за его расходом при работе анализатора. После приготовления реагента неокращенную полоску на бутыли следует закрыть полоской бумаги или другим подходящим материалом, чтобы защитить реагент от света. [c.54]

В подготовленную таким образом бутыль помещают 1 л 4 н. натрийацетатного буфера и 3 л метилцеллозольва. (Осторожно Метилцеллозольв токсичен. Работать в вытяжном щкафу ) Закрепляют на бутыли пробку с входной и выходной трубками для азота и нингидринового реагента соответственно. [c.54]

Один литр 4 н. натрийацетатного буфера, необходимого для получения нингидринового реагента, готовят следующим образом. [c.54]

При приготовлении описанного выше нингидринового реагента нам не раз приходилось встречаться с трудностями. Эти трудности обычно приписывались качеству метилцедлозольва. Важно, чтобы метилцеллозольв не только не содержал следов перекисей (<3 млн. д.), которые мешают протеканию цветной реакции с нингидрином, но и не вызывал помутнения раствора, как это бывает с некоторыми партиями, после контакта с воздухом (особенно если последний попадает при перемешивании нингидринового реагента). При использовании такого недоброкачественного метилцеллюлоза в ходе анализов образуется белый осадок, который удерживается на внутренних стенках трубки реактора и в кюветах колориметра. Этот осадок не похож на гидриндантин, так как он нерастворим в метилцеллозольве, но растворяется в разбавленной кислоте. Для уменьшения образования этого осадка после нингидринного насоса помещают специальный фильтр. [c.55]

Кислые и нейтральные аминокислоты. Скорость подачи буфера 68 мл/ч, нингидринового реагента —34 мл/ч температура колонки (на выходе из рубашки) 55,2 °С. Через 85 мин после начала анализа первый 0,2 н. натрийцитратный буфер pH 3,25 + 0,01 заменяют на 0,2 н. натрийцитратный буфер pH 4,30 0,02. В этих условиях на колонке развивается давление около 9 атм, а продолжительность анализа составляет 180 мин, включая определение фенилаланина. [c.58]

Основные аминокислоты. Скорость подачи буфера и нингидринового реагента устанавливается соответственно на 70 и 35 мл/ч температура колонки 53,4 +0,05 °С. Используют 0,35 н. натрийцитратный буфер pH 5,35 + 0,01. Продолжительность анализа, включая определение триптофана, лизина, гистидина, аммиака и аргинина, составляет 48 мин. [c.60]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология