Аффинные лиганды плотность

Разновидность количественной аффинной хроматографии — фронтальный анализ [10] он основан на понятии плотности о аффинного лиганда на единицу длины колонки с агарозой. Если / — общая длина колонки с агарозой, а Li — общее количество им мобилизованного лиганда в сорбенте, то о = - г/ - Если аффинный сорбент характеризуется слабым сродством, то раствор фермента в концентрации [ 0] наносится на колонку непрерывно, а для элюирования фермента с колонки необходим объем V. Можно написать следующее уравнение [c.51]

В табл. 8.4 приведены количества аффинного лиганда, связанного с 2, 4 и 6%-ной агарозой, а также рассчитанные значения ожидаемой плотности гидроксильных групп в различных гелях агарозы. Выход в реакции химического присоединения для [c.192]

Содержание связанного с гелем аффинного лиганда можно определить по разности между общим количеством добавленного к реакционной смеси аффинного лиганда и выделенного в результате исчерпывающих промывок. Несмотря на то что такой метод иногда используется, он дает неточные результаты, особенно если ковалентно присоединяется небольшая доля добавленного лиганда или если аффинный лиганд плохо растворим и требуются большие объемы для отмывания несвязавшегося вещества. Однако метод пригоден для приблизительной оценки количества присоединившегося лиганда. Например, количество связанной ДНК определялось по разности оптической плотности при 260 нм исходного вводимого раствора ДНК и конечного промывного раствора [58]. [c.244]

Эффективная активность лиганда под влиянием иммобилизации может меняться самым различным образом. На взаимодействие иммобилизованного лиганда с выделяемыми молекулами может оказывать значительное очень разнообразное влияние микроокружение, образуемое матрицей (плотность заряда, стерические препятствия и т. д.) оно же может также влиять и на структуру аффинного лиганда. Иммобилизация приводит также к изменениям в химической структуре, которые различным образом изменяют его молекулярные свойства. Так, например, существенную роль играет число связей между аффинным лигандом и нерастворимым носителем. Из сопоставления результатов, представленных на рис. 10,10,6 и в, следует, что неблагоприятное влияние возрастающего числа связей между молекулами соевого ингибитора трипсина и сефарозой 4В вызвано увеличением pH с 7,2 до 8,5 во время связывания белка после активации бромцианом. [c.274]

При синтезе аффинного сорбента (если считать, что все его ком-поненты выбраны обоснованно) перед экспериментатором встают практические вопросы количественных соотношений, и в первую очередь задача выбора оптимальной концентрации (плотности пространственного расположения) лиганда на матрице. Для этого в описанных выше процедурах посадки лиганда он может варьировать соотношения количеств лиганда и матрицы, а также условия реакции, в частности ее продолжительность. Хотя подбор оптимальной концентрации лиганда в конце концов ведется эмпирически, имеет смысл провести некоторое общее рассмотрение этого вопроса, с тем чтобы прояснить хотя бы порядки величин, с которых следует начинать такой подбор в каждом конкретном случае. [c.400]

Разрешающая способность этого метода аффинной хроматографии для нуклеиновых кислот в большинстве случаев превосходит результаты фракционирования ДНК в градиенте плотности в присутствии лигандов, специфичных к парам оснований. [c.177]

ЛИТЬ оптимальную для данного подвижного компонента концентрацию лиганда. По другому способу носитель вводят в реакцию с большим количеством лиганда и затем разбавляют немодифицированной матрицей до достижения требуемой концентрации иммобилизованного лиганда. Последний метод менее желателен в случае, если высокая плотность лиганда концентрированной аффинной матрицы вызывает удерживание подвижного компонента благодаря поливалентному связыванию или стерическим трудностям. [c.226]

Принцип фракционирования схематически показан на рис. 7.3. Вначале мембраны физически нарезают на крошечные везикулы. Частицы высокой плотности, с которыми ковалентно связан специфический для выделяемого рецептора аффинный лиганд, добавляются к мембранным фрагментам, несущим данный рецептор. Образующийся между добавленным аффинным лигандом и мембранными частицами комплекс быстро отделяется на ультрацентрифуге, поскольку имеет большую плотность. Для того чтобы избежать трудностей, обусловленных небольшими количествами соответствующих рецепторов, мембраны и аффинные лиганды хметят разными радиоактивными изотопахми. Образование комплексов между мембраннымп фрагментами и аффинными частицами может быть блокировано или, если необходимо, исключено путем добавления реагентов с более высоким сродством к аффинному лиганду, чем у данного рецептора, или путем введения избытка аналога рецептора, обладающего близким сродством. Частицы, изменяющие плотность, могут быть видимы в электрон- [c.165]

Рис. 5. Аффинная хроматография с конкурентным зональным элюированием для системы с бивалентным связыванием. Зоны (100 мкл) мономера [ ]IgA (бивалентное связывание) наносми на фосфорилхолин-сефарозу с высокой плотностью лиганда (7X25 мм, [Ь]=5-10-5 моль/л), уравновешенную МаСЬ натрийфосфатным буфером (содержащим 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) фосфорилхолин имел следующие концентрации (моль/л) 7 — 0 2—1 10- 5 —2,5-10-6 4 — 5,010- 5 — 7,5-10- 5—1,0-10-5. Элюирование осуществляли при комнатной температуре буфером, содержащим указанное количество растворенного конкурентного фосфорилхолина. В правом верхнем углу по данным элюирования построена зависимость 1/(К—Уо) от концентрации фосфорилхолина. Константы диссоциации /Сь и /Сп рассчитаны с помощью этого графика с использованием уравнения (5) и приведены в табл. I [9].

Справочник химика 21

Химия и химическая технология