Элюирование зональное

В связи с тем что в Великобритании принято постановление, касающееся здоровья и безопасности при проведении работ, необходимо учитывать степень опасности, возникающей при осуществлении различных радиохроматографических операций. Сейчас установлено, что работа с порошками силикагеля в лаборатории без определенных предосторожностей нежелательна, так как работающий при этом подвергается некоторому (хотя и меньшему, чем на промышленных предприятиях) риску заболевания силикозом. В связи с этим все методы исследования тонкослойных пластинок с силикагелем, которые включают процедуру соскабливания порошка с пластинки, например зональный анализ, анализ с элюированием или сжиганием, связаны с определенной сте- [c.101]

Фронтальная хроматография отличается от зонального варианта лишь объемом раствора, вводимого на колонку. На колонку вводится объем раствора, достаточный для того, чтобы профиль элюирования содержал участок плато, в котором концентрации всех растворенных реагентов равны их концентрациям во вводимом растворе. Как и в зональном методе, рекомендуется элюирование буфером. Полученные таким образом кривые элюирования представляют собой комбинацию двух участков начального участка (восходящий профиль), отражающего увеличение концентраций всех растворенных компонентов от нуля до концентраций наносимой на колонку смеси, и конечного участка (нисходящий профиль), соответствующего уменьшению концентраций всех компонентов от значения плато до нуля. В количественной аффинной хроматографии, где обычно используются процессы связывания, происходящие количественно, т. е. специфично для суммарной концентрации растворенного вещества, объем элюирования Уа может быть получен как среднее значение сечения (центроида) [29] начального или конечного участка кривой элюирования. Положение этого сечения определяется математическим выражением [c.198]

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ С ЗОНАЛЬНЫМ ЭЛЮИРОВАНИЕМ И АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ [c.217]

Методика зонального элюирования в аналитической аффинной хроматографии была разработана фактически параллельно с методикой постоянного элюирования/фронтального анализа (гл. 6). Благодаря прежде всего экспериментальной простоте, зональный метод нашел широкое применение для биохимического анализа биомолекулярных взаимодействий, при которых одно из реагирующих веществ может быть иммобилизовано с сохранением способности биоспецифического связывания. Поскольку метод может быть использован для анализа очень небольших количеств подвижного компонента, он имеет важное значение [c.218]

Ниже рассмотрены основные экспериментальные особенности и подходы аналитической аффинной хроматографии с зональным элюированием. Обсуждаются свойства аффинной матрицы и растворенного реагирующего вещества в отношении их применимости для аналитических (в отличие от препаративных) экспериментов. В заключение представлены примеры, показывающие возможности рассматриваемого метода для изучения нескольких систем, относящихся к взаимодействию белок — лиганд и белок — белок. [c.218]

ЗОНАЛЬНОЕ ЭЛЮИРОВАНИЕ В АНАЛИТИЧЕСКОЙ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ [c.218]

Ниже приведено описание общей методики аффинной хроматографии взаимодействующего растворенного компонента на матрице с иммобилизованным биоспецифическим лигандом при зональном элюировании. [c.218]

Ниже рассмотрены общие методологические особенности аффинной хроматографии с зональным элюированием. [c.219]

Зональное элюирование обычно проводят на небольших колонках объемом, как правило, 1—10 мл с узким внутренним диаметром (7—10 мм). [c.219]

Содержание белка в зоне, введенной в колонку, должно быть минимальным (разд. 3.1). Для проведения анализов с зональным элюированием, когда работают с очень небольшими количествами подвижного компонента, преимущественно используют чувствительные методы детектирования, такие, как определение радиоактивности, радиоиммунный и ферментативный анализ. [c.221]

В некоторых случаях может быть желательно или необходим МО проводить зональное элюирование в отсутствие конкурирующего растворимого лиганда ([Ь]=0). В этом случае уравнение (2) упрощается [c.223]

В отсутствие конкурирующего лиганда [Ь]=0, тогда Кь пропорциональна 1/(У—Уо). Таким образом, для матрицы с постоянным значением [Ь], использованной для конкурентного зонального элюирования, Кь можно достаточно надежно найти по одной кривой элюирования. [c.223]

Важное условие зональной аналитической аффинной хроматографии состоит в том, что концентрация подвижного компонента [Р] по мере прохождения зоны через слой адсорбента постоянно изменяется. Поэтому члены, содержащие [Р], не включаются в выражения, относящиеся к объемам элюирования и константам диссоциации (см., например, приведенные выше уравнения). Пренебрежение [Р] допустимо только в том случае, если этот параметр мал по сравнению с константой диссоциации /Сь- Проведение экспериментов по зональному элюированию при низком [р] обычно легко осуществимо и особенно желательно при анализе труднодоступных биомолекул. Использование низких [Р] в зональном анализе аналогично применению низких концентраций фермента в твердофазном ферментативном кинетическом анализе [7]. Было экспериментально показано (например, в работе [5]), что при низком (по отношению к /Сх) количестве фермента, введенного в аффинную матрицу, рассчитанные константы диссоциации практически не зависят от количества использованного подвижного компонента. В то же время в работе [8] предложены уравнения расчетов по методу постоянного элюирования/фронтального анализа, в которые входит точное значение концентрации подвижного компонента, нанесен ного на аффинную колонку (см. также гл. 6). С практической точки зрения метод зонального элюирования экспериментально более удобен и требует гораздо меньшего количества подвижного компонента. Таким образом, зональное элюирование, по-видимому, наиболее подходящий метод для изучения большинства взаимодействий, представляющих биологический интерес. Следовательно, существует необходимость в чувствительных аналитических методах для проведения элюирования и детектирования малых количеств подвижного компонента. [c.223]

Хроматография с зональным элюированием может быть также использована для расчетов в системах бивалентного связывания, включая представленные в уравнении (4). [c.224]

Если зональное элюирование осуществляется в отсутствие растворимого лиганда ([Ь] =0), уравнение (5) упрощается [c.225]

При установлении констант равновесного связывания по данным хроматографии с зональным элюированием весьма важно, чтобы емкость колонки и сродство подвижного компонента к иммобилизованному лиганду соответствовали друг другу, только тогда можно получить в течение разумных промежутков времени вполне четкие кривые элюирования. Получение четких кривых элюирования зависит от ряда параметров, таких, как размер шариков и пор матрицы, диаметр и длина колонки и скорость потока [11, 12]. Кроме того, удерживание подвижного компонента непосредственно зависит от количества лиганда, присоединенного к матрице [1, 3]. При постоянной скорости потока и постоянном объеме колонки зоны подвижного компонента, введенного на матрицу с меньшим количеством иммобилизованного лиганда, элюируются в виде более острых пиков при меньших объемах элюирования. Увеличение количества иммобилизованного лиганда приводит к более широким пикам и большим объемам элюирования. Для установления соответствующей концентрации иммобилизованного лиганда для данной серии экспериментов обычно прибегают к методу проб и ошибок. Концентрация присоединенного к твердому носителю лиганда может первоначально контролироваться путем введения в реакцию с активированным твердым носителем определенных количеств лиганда. Дальнейшим исследованием ряда препаратов матрицы с различной плотностью лиганда можно опреде- [c.225]

Измерение радиоактивности. Радиоактивно меченные образцы могут быть определены с высокой чувствительностью. Так, когда контроль элюирования по другим характерным для данной молекулы активностям недостаточно чувствителен, введение радиоактивной метки (радиоактивного изотопа) дает возможность определения небольших количеств подвижного компонента, с которыми и имеют дело в аффинной хроматографии с зональным элюированием (см. разд. 2 или 3,1). Определение радиоактивности меченных образцов является прямым методом. При использовании углерода-14 и трития в качестве радиоактивных меток измерение радиоактивности проводят на сцинтилляционном счетчике измеряемые образцы готовят путем смешивания определенной аликвоты жидкого сцинтиллятора с соответствующим количеством (для достижения равного гашения компонентами буфера) каждой фракции элюата. Введение в хроматографическую систему сцинтилляционного счетчика дает возможность исключить необходимость отбора образцов, хотя по крайней мере для существующих приборов чувствительность детектирования при этом уменьшается. [c.232]

ПРИМЕРЫ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИТИЧЕСКОЙ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ЗОНАЛЬНЫМ ЭЛЮИРОВАНИЕМ [c.233]

Поведение БНФ-П при зональном элюировании с Ме1-Туг-РЬе-аминоалкил-агароз соответствует схеме кооперативного связывания, отличающейся от строго моновалентных или бивалентных моделей. Объемы элюирования обычно уменьшаются с увеличением концентрации конкурентного пептида (например, окситоцина или вазопрессина) в элюирующем буфере, как показано, например, на рис. 3. Однако, когда полученные при кон- [c.237]

Аналитическая аффинная хроматография с зональным элюированием была изучена на многих макромолекулярных системах. Было показано, что этот метод достаточно простой в экспе- [c.240]

В начале этой главы отмечалось, что некоторые методы измерения радиоактивности в ТСРХ являются разрушающими и в этом случае обратное извлечение меченых соединений становится трудной задачей. Зональный анализ, анализ с элюированием, как и метод сжигания, относятся к числу разрушающих методов, и их нельзя применять в том случае, когда количество меченого вещества для хроматографии ограничено. Однако очень часто для анализа можно взять узкую полоску хроматограммы, при этом теряется лишь часть пробы. Если же потери недопустимы, то можно воспользоваться методами радиосканирования или авторадиографии. [c.100]

Разработан ряд радиоактивных методов количественного определения соединений, разделенных ТСХ. Пробы можно пометить прямой реакцией с компонентами, например путем этерификации кислот радиоактивным диазометаном [309], или методом изотопного разбавления, добавляя известное количество радиоактивного компонента к разделяемой смеси [186, 310]. Шульце и Венцель [311] пользовались методикой Вильц-баха [311, 312] и метили соединения тритием. Эти соединения, разделенные на слоях, можно определить методами 1) авторадиографии 2) автосцинтиллографии 3) элюированием с последующим анализом радиоактивности 4) сканированием полос детекторами Гейгера — Мюллера 5) сканированием полос детекторами на фотоэлементах 6) двумерного сканирования с использованием детектора нового типа на электронных умножителях, 7) двумерного сканирования с -камерой 8) сжигания 9) зонального профильного сканирования с использованием жидкостного сцинтилляционного детектирования и 10) сублимационной автографии. Радиоактивным методам и применению их в ТСХ посвящен ряд обзоров и статей [313—316]. [c.353]

Зональный метод количественной аффинной хроматографии [1, 2, 5] в настоящее время пользуется большей популярностью, чем фронтальный, главным образом из-за применения в последнем методе слишком большого количества растворенного вещества. Однако различия в требуемом количестве растворенного вещества не так велики, как может показаться на первый взгляд. Хотя в случае фронтального эксперимента объем вводимого раствора гораздо больше, концентрация может быть значительно ниже ввиду отсутствия далее в работе какого бы то ни было разбавления. Это положение становится совершенно очевидным из рис. 1, на котором представлены восходящие профили элюирования при различных концентрациях NADH при фронтальной аффинной хроматографии лактатдегидрогеназы печени крысы на колонке объемом 0,1 мл (0,08x5,0 см) с 10-карбокси-дециламино-сефарозой в сравнении с соответствующими профилями, полученными при зональной хроматографии на колонке с тем же аффинным адсорбентом, объем которой в 10 раз больше (0,50X1,28 см) [20]. [c.199]

Рис. 1. Сравнение влияния концентрации NADH на кривые элюирования при фронтальной и зональной хроматографии лактатдегидрогеназы печени крысы на 10-карбоксидециламино-сефарозе. а — начальные участки кривых элюирования, полученные при фронтальной хроматографии фермента (9 нМ) на колонке (0,1 мл) в отсутствие NADH (/) и в присутствии 2 (-2), 3 3),

В одном из них [14] для интерпретации фосфорилхолинзависи-мого элюирования иммуноглобулина А с сефарозы, содержащей ковалентно связанный фосфорилхолин (иммобилизованный реагент X), был использован приближенный анализ [17] результатов зональной хроматографии. Другие исследования были посвящены фосфатзависимому элюированию альдолазы с фосфо-целлюлозы [18] и с миофибрилл мышц кролика [28] и ЫАОН-зависимому элюированию лактатдегидрогеназы с 10-карбокси-дециламино-сефарозы [32]. Все четыре системы относятся к примеру 3, включающему конкуренцию между 5 и X за положения связывания растворенного вещества. [c.207]

Рис. 2. Схематическая диаграмма аффинной хроматографии с конкурентным зональным элюированием, изображающая взаимодействия подвижных и иммобилизованных компонентов, В приведенном примере элюирующий буфер содержит растворимый лиганд, конкурирующий с иммобилизованным лигандом за связывание с тем же активным положением подвижного компонента (в данном случае белка) [3].

Рис. 3. Примеры кривых конкурентного зонального элюирования в ряде экспериментов с системой нейрофизин — пептид, показывающих хроматографическое поведение зон белка, элюированных с иммобилизованного лиганда увеличивающимися количествами конкурентного лиганда в элюирующем буфере. Зоны (каждая по 100 мкл на 2 мл адсорбента) [ 251]-меченного бычьего нейрофизина II элюировали с Ме1-Туг-РЬе-аминобутил-агарозы 0,4 М ацетатом аммония (pH 5,7), содержащим конкурентный лиганд лизинвазо-прессин при различных концентрациях. Увеличение концентрации растворенного конкурирующего лиганда приводит к пропорциональному уменьшению объемов элюирования меченого белка [4].

При [Ь]=0 /Си можно найти непосредственно по объему элюи-рования при одном зональном элюировании. [c.225]

С использованием количественной аффинной хроматографии с зональным элюированием был изучен ряд взаимодействующих систем белок — лиганд и белок — белок. Ниже приведены несколько типичных примеров, показывающих обычные хроматографические результаты, получаемые при изучении моновалентных (например, нуклеаза стафилококков — нуклеотид), бивалентных (например, ТЕРС 15 IgA бивалентный мономер — фосфорилхолин) и кооперативных (например, БФН-П — пептидный гормон) взаимодействующих систем. [c.233]

Рис. 4. Аффинная хроматография с конкурентным зональным элюированием для системы с моновалентным связыванием. Зоны, содержащие равные количества нуклеаз стафилококков, наносили на колонку с рс1ТрАР-сефа-

Рис. 5. Аффинная хроматография с конкурентным зональным элюированием для системы с бивалентным связыванием. Зоны (100 мкл) мономера [ ]IgA (бивалентное связывание) наносми на фосфорилхолин-сефарозу с высокой плотностью лиганда (7X25 мм, [Ь]=5-10-5 моль/л), уравновешенную МаСЬ натрийфосфатным буфером (содержащим 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) фосфорилхолин имел следующие концентрации (моль/л) 7 — 0 2—1 10- 5 —2,5-10-6 4 — 5,010- 5 — 7,5-10- 5—1,0-10-5. Элюирование осуществляли при комнатной температуре буфером, содержащим указанное количество растворенного конкурентного фосфорилхолина. В правом верхнем углу по данным элюирования построена зависимость 1/(К—Уо) от концентрации фосфорилхолина. Константы диссоциации /Сь и /Сп рассчитаны с помощью этого графика с использованием уравнения (5) и приведены в табл. I [9].

Рис. 6. Конкурентное зональное элюирование бивалентных мономеров IgA с фосфорилхолин-сефарозы с низким содержанием лиганда. Зоны мономера [ ]IgA нан или на фосфорилхолин-сефарозу с низкой плотностью лиганда (7x25 мм, [L]=9-10 моль/л) условия элюирования аналогичны приведенным на рис. 5 для колонки с фосфорилхолин-сефарозой с высокой плотностью использованы следующие концентрации растворенного фосфорилхолина (моль/л) /-0 2—ЫО- 5-5-10" -i-ЫО-в 5 —2,5-10- .

Степень димеризации нейрофизина была установлена при элюировании нейрофизина с иммобилизованного нейрофизина. Как показано в правом верхнем углу рис. 10, зональное элюирование БНФ-П в буфере (не содержащем растворенного пептидного лиганда) свидетельствует об удерживании, достаточно отличающемся от Уо что позволяет рассчитывать константу димеризации как /Сь (табл. 1). При включении растворимого [c.240]

Рис. 9. Влияние концентрации введенного на колонку бычьего нейрофизина II (БНФ-П) на характер зонального элюирования с Ме1-Туг-РНе-амино-бутил-агарозы. Зоны (100 мкл), содержащие <1 мкг .Бр ф.ц

Рис. 10. Элюирование [ 51]-БНФ-П с БНФ-П-сефарозы в присутствии и отсутствие растворенного пептидного лиганда—лизинвазопрессина. Зоны (300 мкл), содержащие 1 мкг [ 51]-БНФ-П, наносили на БНФ-сефарозу (объем сорбента 1,5 мл, [Ь] = 1,4-Ю- моль/л), уравновешенную 0,4 М ацетатом аммония (pH 5,7), содержащим 0,1 ммоль/л лизинвазопрессина (основной график) или в отсутствие лизинвазопрессина (график в правом верхнем углу). Объемы зонального элюирования были использованы для расчета константы диссоциации для взаимодействия белок — белок по уравнению (3). Эти значения приведены в табл. 1 [21].

Справочник химика 21

Химия и химическая технология