Анионообменная хроматография нуклеотидов

Основные преимущества тонкослойной хроматографии — четкое разделение отдельных соединений, высокая чувствительность, простота и быстрота. Если для разделения оснований и нуклеозидов наиболее подходит тонкослойная хроматография на целлюлозе, то нуклеотиды лучше разделять на тонких слоях анионообменников. Двумерная тонкослойная анионообменная хроматография позволяет разделять такие сложные смеси нуклеотидов, которые трудно разделить путем хроматографии на бумаге или на одной колонке. [c.31]

В большинстве систем, используемых для разделения производных нуклеиновых кислот при помощи хроматографии на колонке, концентрация элюента увеличивается ступенчато. В некоторых случаях, например при разделении сложной смеси нуклеотидов, более пригоден метод градиентной элюции на анионообменной смоле. При pH такой колонки (pH 7—8) суммарный заряд нуклеотидов оказывается отрицательным, причем с понижением pH заряд уменьшается и притяжение нуклеотидов к смоле ослабевает. Это достигается путем пропускания через смолу растворов соответствующей кислоты во все возрастающих концентрациях для последовательной элюции отдельных нуклеотидов. Затем для элюции нуклеотидов, более прочно удерживаемых смолой, к [c.32]

Величины Rf, полученные для нуклеотидов на слоях PEI-цел-люлозы в различных растворителях, приведены в табл. 24.3. Пользуясь таблицами для выбора подходящих растворителей в зависимости от состава разделяемых смесей, чаще всего удается подобрать такие смеси, которые позволят добиться отличного разделения в две—пять стадий. Очень сложные смеси полинуклеотидов К- Рандерат и Э. Рандерат [68] анализировали методом двустадийной анионообменной хроматографии на тонких слоях полиэтилениминцеллюлозы. Насколько эффективен этот метод, предполагающий многостадийное элюирование, показывает рис. 24.1. Сначала авторы [68] проводили элюирование пробы растворами хлорида лития различной концентрации 2 мин 0,2 М раствором, затем сразу же (без промежуточной сушки) 6 мин 1,0 М раствором и в заключение 1,6 М раствором при общей длине пути элюирования 13,0 см. Все три элюирования велись в одном и том же направлении. После сушки в токе теплого воздуха при температуре < 50°С часть слоя, не нужную для элюирования во втором направлении, соскребали с пластинки, Далее пластинку погружали на 15 мин в 1 л безводного метанола, чтобы удалить хлорид лития. (Время от времени метанол перемешивали, чтобы ускорить растворение солей.) После этого пластинку осторожно (в мягких условиях) сушили, чтобы удалить метанол, и затем элюировали в три стадии буферными растворами муравьиная кислота—формиат натрия (pH 3,4). Сначала элюировали 0,5 М раствором (30 с), затем 2,0 М (2 мин) и наконец 4,0 М при общей длине пути элюирования 15 см. Промежуточной сушки пластинки и в этом случае не проводили. [c.130]

Применение ионообменной хроматографии для анализа смесей нуклеотидов явилось логическим развитием этой техники разделения неорганических ионов. Хронологически катионообменная хроматография была изучена раньше анионообменной, однако последний метод дает наилучшие результаты по разделению фосфорных эфиров [3]. Адсорбция смеси фосфатов на анионообменной смоле с последующей элюцией их возрастающей концентрацией Кислоты или соли является стандартным приемом для выделения и анализа нуклеотидов. Позднее были применены ионообменные целлюлозы и декстраны, преимущества которых заключаются в [c.132]

Факторы, влияющие на разделение аминокислот, описаны в разд. 1.4. В некоторых случаях анионная форма смолы дает определенные преимущества, которые помогают в разделении аминокислот и пептидов благодаря их способности образовывать более прочные связи за счет ионизированных карбоксильных групп. Партридж [91] использовал анионообменную смолу для хроматографии аминокислот в этих условиях аминокислоты и пептиды, несущие наименьший отрицательный заряд, связываются смолой в щелочной среде чрезвычайно слабо. Анионооб-менные смолы нашли также применение для разделения нейтральных сахаров в виде боратных комплексов (Оме [92], Грин [93]) было также достигнуто разделение на одной анионообменной колонке смеси оснований, нуклеозидов и нуклеотидов [94]. [c.20]

Хроматография на бумаге и ионофорез на бумаге очень удобны для разделения небольших количеств исследуемого материала. Для разделения больших количеств оснований, нуклеозидов и нуклеотидов в настоящее время широко используется хроматография на колонках из ионообменных смол. Впервые эти методы были предложены Коном и его сотрудниками [6, 7], которые пользовались колонками из катионообменной смолы дауэкс-50 и анионообменной смолы дауэкс-1 и дауэкс-2. Смесь нуклеотидов поглощается колонкой, через которую затем пропускают элюирующий раствор, содержащий конкурентный ион. Элюат собирают небольшими фракциями и в каждой из них определяют концентрацию основания или нуклеотида, используя для измерения оптической плотности ультрафиолетовый спектрофотометр. [c.32]

Смешанные механизмы удерживания. Обсуждая выше условия ионообменной хроматографии, мы полагали, что механизмы удерживания, отличные от процесса ионного обмена, не играют существенной роли. Например, при выводе уравнений (3.78)— (3.82) мы предполож или, что в неподвижной фазе отсутствуют другие формы хроматографируемого компонента, такие, например, как протонированная форма аниона (ИХ). На практике это предположение не всегда является корректным. По этой причине различные неподвижные фазы с одинаковыми функциональными группами могут иметь различную селективность. Например, в работе [67] показаны различия в селективности при разделении нуклеотидов на двух различных сильных анионообмен- [c.110]

В продаже имеются также разнообразные целлюлозные катионо- и анионообмешшки для тонкослойной хроматографии. Особенно четкое и хорошо воспроизводимое разделение нуклеотидов авторы этой статьи получали на слоях анионообменной ПЭИ-целлюлозы, приготовленной в их лаборатории [4, 5]. ПЭИ-целлюлозу синтезировали, обрабатывая немодифици-рованную целлюлозу полиэтиленимином. По сравнению со слоями из замещенной анионообменной целлюлозы слои из ПЭИ-целлюлозы характеризуются значительно большей емкостью [5]. [c.31]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология