Сывороточный альбумин гель-фильтрация

Обратимые реакции с низкомолекулярными соединениями характерны не только для ферментов, но также и для белков сыворотки. Здесь особый интерес представляют исследования по связыванию сывороточными белками фармацевтических препаратов и металлов (см. литературу, приложение III). Описанные в литературе опыты по качественному и количественному изучению таких комплексов также свидетельствуют о том, что гель-хроматография оказалась полезной и в этой области. В некоторых экспериментах сухой сефадекс вносили в раствор обоих компонентов. Сочетание в этих опытах гель-фильтрации с центрифугированием (см. гл. II), несомненно, позволило бы получить еще более точные результаты. На колонках изучалось взаимодействие триптофана и некоторых его производных с сывороточным альбумином, при- [c.148]

Феноловый красный в сыворотке связывается исключительно с сывороточным альбумином, причем эта связь, обратимая при pH 8,5, наиболее прочна при pH 4,5 [33]. Гель-фильтрация позволяет использовать это явление для определения содержания альбумина в сыворотке. С помощью гель-фильтрации было показано, что прогестерон в плазме связан с двумя независимыми системами, различающимися по емкости и степени сродства к нему [34]. [c.149]

Как известно, конформацию белковой молекулы можно нарушить посредством какого-либо внешнего воздействия. Такое нарушение ведет к увеличению объема молекулы, что проявляется в снижении объема выхода. Так, диаграмма элюирования сывороточного альбумина на сефадексе 0-200 мочевиной (5 М) содержит два пика, тогда как обычно его /Саг) = 0,43. Первый компонент элюируется гораздо раньше (/Са = 0,1) около 60% белка не претерпевает никаких изменений [76]. Вполне возможно, что часть молекул денатурировалась и занимает поэтому больший объем. По изменению объема выхода можно непосредственно проследить за различными стадиями денатурации белка [77]. Так, молекулярный вес рибонуклеазы, установленный на сефадексе 0-100, увеличивается после денатурации щелочью в 1,9 раза, после окисления надмуравьиной кислотой — в 3,0 раза, после обработки 4 М мочевиной — в 2,5 раза, а после обработки 8 М мочевиной — в 4,3 раза. Как можно убедиться с помощью гель-фильтрации на сефадексе 0-200 [160], химическая модификация сывороточного альбумина (ацилирование различными реагентами) приводит к весьма значительному увеличению объема. [c.171]

Рис. 6. Двумерное разделение лиофилизованного гормона роста человека сочетанием методов гель-фильтрации и электрофореза на сефадексе 0-200. Разделение позволило обнаружить значительную гетерогенность препарата, а—лиофилизованный гормои роста б—сывороточный альбумин человека 150],

Рис. 5.2. Аффинная гель-фильтрация синтетических смесей (объем образца 50 мкл) бычьего сывороточного альбумина (0,8 мг) с лактатдегидрогеназой (1,85 Е) (о) и малатдегидрогеназой (0,335 Е) (б) [18].

Отделение суммарной фракции IgG начинают с фракционирования сывороточных белков сульфатом аммония (СА). Напомним, что глобулины отличаются от альбуминов именно тем, что они нерастворимы в водном растворе СА, концентрация которого составляет 50% от насыщающей. Поэтому очистку начинают с осаждения глобулинов, для чего в антисыворотку добавляют сухой СА до концентрации 50% от насыщения (примерно до 2М), осадок растворяют и операцию осаждения СА повторяют еще раз. Соль из вновь растворенного осадка удаляют диализом или гель-фильтрацией. Нередко для лучшей очистки проводят осаждение меньшей концентрацией СА (33% от насыщения), для чего к данному объему антисыворотки добавляют половинный объем насыщенного раствора СА и эту операцию после растворения осадка в воде повторяют 3—4 раза. Разумеется, за улучшение очистки при этом приходится расплачиваться некоторым уменьшением выхода IgG. [c.108]

Поскольку при элюировании фронт растворителя неразличим, скорость движения растворителя определяют и регулируют с помощью соединений-маркеров. Для этой цели служат окрашенные белки природного происхождения, например гемоглобин и цитохром с [9] или же белки с флуоресцентной меткой, присоединенной, например, с помощью флуоресцеинизотиоцианата [8]. Однако наиболее подходящими и хорошо различимыми маркерами являются, по-видимому, бычий сывороточный альбумин и альбумин человека, окрашенные амидо-черным В [14]. Декстра-новый синий, применяемый в гель-фильтрации на колонках для определения свободного объема, является плохим маркером, поскольку при фракционировании он имеет обыкновение давать хвосты . В зависимости от скорости движения маркеров регулируют угол наклона пластинки, задавая тем самым скорость движения элюента. При работе на сефадексе 0-200 скорость веществ, мигрирующих со свободным объемом (т. е. не проникающих в гранулы геля), не должна превышать 2 см/ч на гелях сефадекса с более высокой степенью сшивки скорость может быть несколько больше. Указать заранее оптимальный угол наклона для данного типа геля невозможно, поскольку он зависит от многих факторов, например от свойств партии геля и консистенции суспензии. Пробег для веществ, мигрирующих со свободным объемом, должен составлять не менее 15 см. При большем пробеге (до 30—40 см) наблюдается лучшее разрешение и вместе с тем не происходит заметного размывания зон. [c.260]

О высокой эффективности разделения белков гель-фильтрацией в тонком слое свидетельствуют результаты модельного опыта, приведенные на рис. 2. В этом случае на тонком сефадексе 0-75 достигнуто полное разделение смеси, содержащей а-лактальбумин, р-лактоглобулин и альбумин из сыворотки быка более того, альбумин дал два пятна, соответствующие мономеру и димеру. При фракционировании на колонке такого разделения достигнуть не удалось [6]. Иоханссон и Римо [8] получили удовлетворительное разделение сывороточных белков на сефадексе 0-200. Белки нормальной сыворотки человека были [c.263]

Для опытов использовался хлористый аммоний особой чистоты А-Г, растворы готовились на свежеперегнанном тридистилляте. Исследование проведено с кристаллическим бычьим сывороточным альбумином фирмы Ko h-Light Laboratories, Ltd. и отчасти с кристаллическим препаратом альдолазы, выделенным из мышц кролика по методу, описанному в работе [6]. Гомогенность белковых препаратов проверялась с помощью гель-фильтрации на сефадексе G-100 и электрофореза в полиакриламидном геле. [c.229]

Реактивация фермента. Прежде всего с помощью гидролиза в мягких условиях снимают ацильные группы модифицированных аминокислот. Раствор белка разбавляют вдвое 0,2 М трис-ацетатным буфером (pH 8,1). При содержании белка <1 мг/мл в раствор добавляют бычий сывороточный альбумин до суммарной концентрации белка 1 мг/мл. Раствор осторожно титруют при комнатной температуре насыщенным (при 23 С, 100%-ное насыщение) сульфатом аммония, подкисленным до pH 2 концентрированной серной кислотой. Белок начинает выпадать в осадок при pH ,6,5. Суспензию выдерживают при pH 4,6 и комнатной температуре в течение 30—60 мин. а затем центрифугируют при 28 ООО и 4 °С в течение 30 мин. Осадок ресуспендируют в охлажденном до 4 X буфере следующего состава 100 мМ калнйфосфат (pH 8,5)+ 10 мМ дитиотрент+0,5 мМ калий ЭДТА+Ю мкМ флавинмононуклеотид. Небольшая примесь бычьего сывороточного альбумина (0,1 мг/мл) способствует растворению осадка. Сульфат аммония удаляют с помощью гель-фильтрации на сефадексе 0-50 в указанном буфере. Обессоленный образец (1—2 мг/мл) инкубируют в буфере для реактивации при 25 °С. [c.60]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология