Альбумин сывороточный, разделение

Рис. 57. Разделение белков при pH 11.5 в немодифицированном капилляре. Буфер 100 мМ борат, pH 11.5 пробы 1 - ОМР, 2 -РНК крупного рогатого скота, 3 - миоглобин кита, 4 - миог-лобин лошади, 5 - кональбумин, 6 - 3 - лактоглобулин, 7 -бычий сывороточный альбумин (БСА), 8 ферритин, 9 - а-амилоглюкозидаза.

При каком значении pH будет достигнуто наиболее эффективное разделение методом электрофореза следующих белковых смесей а) многлобин и химотрипсиноген б) яичный альбумин и пепсин в) сывороточный альбумин и гемоглобин (р/ белков приведены в таблице) [c.36]

Электрофоретическое разделение белков в водной среде основано на способности их заряженных частиц перемещаться относительно растворителя под влиянием внешнего электрического поля. Если концентрация водородных ионов в растворителе не равна изоэлектрической точке, то скорость перемещения частиц зависит от величины их свободного заряда, размера и формы. Поскольку даже близкородственные белки, например, некоторые фракции сывороточного альбумина, имеют весьма различную электрофоретическую подвижность и поскольку их подвижность изменяется неодинаково при изменениях pH и состава буферных растворов, электрофорез может быть с успехом применен для разделения белковых смесей и характеристики отдельных белков. [c.164]

После установления условий проведении количественной нингидринной реакции Муру и Штейну удалось в 1948 г. разделить 2,5 мг гидролизата сывороточного альбумина быка с помощью распределительной хроматографии на колонке с крахмалом. Элюат был разделен на 4(Ю фракций, в каждой фракции проведена нингидринная реакция, и из интегральных кривых поглощения, соответствующих отдельным аминокислотам, рассчитывались их молярные доли в смеси. На коллег-современников большое впечатление произвели высокая скорость анализа (I нед), малое количество анализируемого вещества и малая погрешность ( 3%). [c.59]

Как и в предыдущих разделах, мы попытаемся кратко рассмотреть применение ионообменной хроматографии на примере изучения белков сыворотки. До сих пор наиболее популярным методом разделения сывороточных белков является хроматография на колонке анионообменной ДЭАЭ-целлюлозы по методу Собера и Петерсона [18]. Предложено несколько модификаций этого метода. Фракции сыворотки элюируются с колонки различными способами градиентного элюирования и выходят обычно в следующем порядке IgG (как правило, имеет несколько пиков), р-, а-глобулины и затем альбумин. Этот метод особенно эффективен для приготовления препаратов IgQ высокой иммунохимической чистоты из нативной сыворотки. Его можно комбинировать с другими способами очистки, например с осаждением риванолом, Na2S04 и т. п. Подобным образом в качестве одного из этапов препаративного выделения анионообменная хроматография может применяться для очистки других белков сыворотки. При изучении структуры белка ее можно использовать для выделения и очистки полипептидов после расщепления белка ферментами или какими-либо другими веществами. [c.23]

Из этого следует, что после равномерной адсорбции белковый слой необходимо обрабатывать сшивающим агентом не только для упрочнения и уплотнения защитного покрытия, но и для максимального изменения его нативной структуры так, чтобы внешняя поверхность представляла собой плотную гидрофильную полимерную сетку, по возможности полностью лишенную какой-либо ферментативной активности. Благодаря своему составу (в основном Ь-аминокислотному), иммобилизованные белки обладают некоторой энантиоселективностью, что может успешно использоваться для разделения оптических изомеров. В частности, в работе [42] и обзорах [43, 44] подробно обсуждаются возможности хирального разделения на неподвижных фазах, модифицированных гликопротеином, бычьим сывороточным альбумином, сывороточным альбумином человека, овомукоидами, трипсином и химотрипсином. [c.545]

За процессом электрофоретического разделения сывороточных белков легко следить, окрасив сыворотку крови конго красным. Краситель связывается с альбумином и мигрирует вместе с ним. Следует отметить, что в результате окрашивания скорость миграции альбумина несколько увеличивается. [c.143]

Фиг. 3. Хроматографическое разделение гидролизата сывороточного альбумина быка [27].

РАЗДЕЛЕНИЕ О, Е-ТРИПТОФАНА АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ НА КОЛОНКЕ С ИММОБИЛИЗОВАННЫМ НА АГАРОЗЕ БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ [c.367]

Наибольшей скоростью прохождения колонки обладают компоненты, не способные проникнуть в зерна гелевой фазы. Сефадексы 0-10 и 0-15 служат для фракционирования низкомолекулярных веществ, первый из них используется для веществ с молекулярным весом до 700, а второй — до 1500. Гели сефадекса 0-25 не способны поглощать, а следовательно, и задерживать перемещение по колонке веществ с молекулярным весом 3500— 4500. Этот предел для сефадекса 0-50 лежит в области значений молекулярных весов 8000—10000, а для сефадекса 0-75 эта величина достигает 40000—50000. Медленно перемещаются по колонке низкомолекулярные вещества, для которых коэффициент распределения между гелевой и жидкой фазами приближается к единице. Во многих случаях компоненты смеси при хроматографическом разделении на сефадексах следуют в порядке уменьшения их молекулярных весов. Однако наблюдается иногда и специфическое сорбционное взаимодействие разделяемых веществ с матрицей сефадекса, что влечет за собой увеличение коэффициента распределения К и снижение скорости перемещения по колонке. Так, замедление движения хроматографических зон наблюдается у основных пептидов и аминокислот в основных растворителях и кислых аминокислот и пептидов в кислых растворителях. Наблюдается также повышение степени удерживания в колонке ароматических веществ при гельфильтрации [22]. Ряд белков, таких как рибонуклеаза, лизоцим, трипсин, бычий сывороточный альбумин, в отсутствие солей также сорбируется и удерживается сефадексом при хроматографии. В связи с этим целесообразно проводить элюирование на сефадексах растворами солей или кислот. [c.202]

Исследование равновесия в растворах между сывороточными белками и различными лигандами, особенно фармакологически активными соединениями, показало значительное различие в константах связывания соответствующих энантиомеров [82, 83]. Этот эффект, однако, более надежно был зафиксирован с помощью хроматографической техники. Так, в 1973 г. ранее известное высокое сродство I -триптофана к бычьему сывороточному альбумину (БСА) было использовано для разделения энантиомеров на колонке, заполненной гелем БСА—сефарозы [84]. Элюирование о-формы проводилось боратным буфером (рН9), а элюирование ь-формы — разбавленной уксусной кислотой. Этот метод был в дальнейшем использован для определения сродства ряда лекарственных препаратов к сывороточным альбуминам [85, 86]. В последние несколько лет аналитические методы хиральной ЖХ, основанные на использовании иммобилизованных белков в качестве неподвижных фаз, развивались очень быстро и нашли применение для решения широкого круга задач. [c.132]

Обычно применяют напряжение 5—10 в на 1 см поперечного сечения полосы высокие градиенты напряжения порождают более высокое разогревание н при этом труднее получать воспроизводимые результаты. До постановки опытов с неизвестным белковым раствором желательно испытать аппарат и подобрать условия для разделения с уже изученным материалом, таким, например, как сывороточный альбумин. При добавлении к сывороточному альбумину небольшого количества раствора бромфенолового синего можно наблюдать за его перемещением. Подходящий буферный раствор можно выбрать, пользуясь табл. 38. [c.250]

СБС приведена на рис. 2. В области коэффициентов набухания смолы СБС выше 3 сорбируемость инсулина (мол. вес 12 000) достигает значительной величины, в то время как сорбируемость белка большого молекулярного веса—сывороточного альбумина (мол. вес 56 ООО)—на том же ионите и в тех же условиях составляет незначительную величину. Смолы типа СБС [21] при больших коэффициентах набухания отличаются еше заметной механической прочностью зерен в растворе, что позволяет осуш,еств-лять разделение на них высокомолекулярных веществ в динамических условиях. [c.226]

Фостера [117]. Область pH 4—9, соответствующая нагивиому состоянию белка -глобулина (минимальные значения вязкости и оптической активности), характеризуется постоянной связывающей способностью белка по отношению к бензолу. Увеличения вязкости и оптического вращения при pH > 9 и < 4 свидетельствуют о глубоких конформационных изменениях в структуре белка. Эти изменения вызывают уменьшение связывания бензола в интервалах pH 9—10 и 4—2, Однако области при pH < 2 и pH > 11 характеризуются возрастанием величины связывания [бензола. В нативном состоянии связывание углеводорода определяется числом и размерами гидрофобных областей. При отклонении в более щелочные и кислые области осуществляется переход из нативного состояния вследствие отталкивания одноименных зарядов в состояние расширенное , характеризующееся раскрытием гидрофобных складок (подобно -форме сывороточного альбумина). Авторы [118] предполагают, что уменьшение связывания углеводородов сывороточным альбумином в результате перехода N Р вызывается частичным разделением четырех субъединиц и разрушением гидрофобных областей, которые расположены в интерфазах этих субъединиц. [c.26]

О высокой эффективности разделения белков гель-фильтрацией в тонком слое свидетельствуют результаты модельного опыта, приведенные на рис. 2. В этом случае на тонком сефадексе 0-75 достигнуто полное разделение смеси, содержащей а-лактальбумин, р-лактоглобулин и альбумин из сыворотки быка более того, альбумин дал два пятна, соответствующие мономеру и димеру. При фракционировании на колонке такого разделения достигнуть не удалось [6]. Иоханссон и Римо [8] получили удовлетворительное разделение сывороточных белков на сефадексе 0-200. Белки нормальной сыворотки человека были [c.263]

Как уже указывалось, глобулины сыворотки могут быть выделены при помощи электрофореза. Нельзя с уверенностью утверждать, что фракции, полученные этим методом, представляют индивидуальные белки, так как в результате ультрацентрифугирования получаются несколько иные фракции и, вообще говоря, по мере усовершенствования методов разделения белков удается получить все большее число фракции . Некоторые фракции сывороточного альбумина содержат гликопротеид. С другой стороны, состав сывороточных белков непостоянен. Исследование иммунологических реакций показало, что в сыворотке животного могут образоваться многочисленные новые белки, не существующие в сыворотке других индивидуумов этого рода. Установлено, что белки такого типа — антитела — составляют фракцию у-гло-булинов. В случае некоторых заболеваний при помощи электрофореза обнаруживают изменение состава белков сыворотки. Таким образом, эти белки являются чрезвычайно сложной смесью. [c.444]

Основными достижениями современной обращенно-фазовой ВЭЖХ как метода разделения белков является разработка неподвижных фаз с большим размером пор (больше 10 нм). Эти фазы обладают большой селективностью и обеспечивают большой выход продукта. Отличные хроматограммы получены на неподвижной фазе на основе силикагеля с порами размером 33 нм. На этих колонках были разделены такие высокомолекулярные белки, как коллаген, сывороточный альбумин, овальбумин, цепи фибриногена, молекулярная масса большинства соединений составляла от 40 до 300 kDa. Выход белкового компонента достигал 85%. [c.57]

Эти смолы и соответствующие им амберлиты ША-400 и Ш-120 употребляются чаще в виде смесей в целях обессоливания белковых растворов, чем для истинных хроматографических операций [35, 36]. В тонкоизмельченном виде эти смолы иногда дают хорошее хроматографическое разделение, однако они обладают одним серьезным недостатком — низкой емкостью. Боман [37] систематически исследовал смолу дауэкс 2 (200—400 меш), имеющую 8—10% поперечных связей, и выяснил ряд интересных фактов. Перед использованием смолу промывают 1 н. раствором НС1. После насыщения смолы буфером при pH 7,3 на ней адсорбируют белки сыворотки при низкой ионной силе (0,02—0,04 М) и элюируют путем ступенчатого повышения молярпости буферного раствора. При использовании катионного буфера трис-НаХ pH регулируется лучше, чем при использовании анионного буфера, например ацетатного. Емкость дауэкс 2 при pH 7,3 для сывороточного альбумина составляет 0,5 лгг/лгуг смолы, поэтому для разделения следует использовать колонку, близкую к пределу насыщения. Как и при работе с фосфатом кальция, индивидуальный блок может элюироваться в виде нескольких небольших пиков, соответствующих разности между теми количествами белка, которые насыщают смолу при данных концентрациях солей. Боман нашел, что порядок элюирования белков сыворотки с дауэкс 2 отличается не только от порядка распределения их при электрофорезе, но также отданных, полученных при разделении на [c.232]

Рис. 6. Двумерное разделение лиофилизованного гормона роста человека сочетанием методов гель-фильтрации и электрофореза на сефадексе 0-200. Разделение позволило обнаружить значительную гетерогенность препарата, а—лиофилизованный гормои роста б—сывороточный альбумин человека 150],

Чтобы разделение осуществлялось строго по размерам молекул, необходимо свести к минимуму электростатическое взаимодействие между пептидами и матрицей. С этой целью применяют буферные растворы с высокой ионной силой и соответствующей величиной pH. Удобно работать с летучими буферными растворами, упомянутыми в предыдущем разделе. В качестве примера успешного разделения пептидов по размерам молекул следует указать получение фрагментов сывороточного альбумина человека [20]. Смесь трех пептидов в виде малеилпроиз-водных фракционировали в 0,1 М растворе бикарбоната натрия на колонке длиной 250 см с сефадексом 0-100. Как и следовало ожидать, первый пик соответствовал наиболее крупному фрагменту, а последующие — среднему и наиболее короткому (рис. 34.1). [c.398]

Под дополнительными методами имеются в виду методы хроматографии на колонке (гл. 4), электрофореза и гель-проникающей хроматографии (гл. 5). В первом случае разделение исследуемых полимерных образцов происходит на основании зависимости растворимости от молекулярного веса и химического состава. Нетрудно понять механизм разделения по молекулярным весам, поскольку растворимость уменьшается при увеличении молекулярного веса. Но растворимость зависит также от присутствия в полимере полярных групп в связи с этим при наличии химической неоднородности происходит фракционирование и по составу молекул. Если полярность групп в разных звеньях макромолекулы примерно одинакова, то фракционирование определяется главным образом величиной молекулярного веса. При больших различиях в степени полярности разных групп влияние полярности может оказаться более сильным, чем влияние молекулярного веса, и разделение на фракции сможет осуществляться преимущественно по химическому строению. Именно на этом было основано разделение сывороточного альбумина лошади и яичного альбумина в водном фосфатном растворе на фракции с различным содержанием.кислых фосфатных групп [17]. Белки с большим содержанием серы были разделены методами хроматографии на фракции с различным содержанием серы и азота [18]. Влияние на результаты фракционирования сродства между исследуемым соединением и материалом носителя было изучено на примере рацемической смеси поли-4-метилгексена-1 [19]. При фракционировании методом хроматографии [c.299]

Общий вид спектра радикала АХЦ14), связанного с сывороточным альбумином (рис. IV.21), соответствует изотропному вращению радикала при частотах, лежащих на границе областей быстрого и медленного вращения (см. раздел II.5, рис. 11.13), однако в низкопольной части спектра заметно усложнение формы спектра, свидетельствующее о двух типах мест посадки радикала АХ1(14) на молекуле белка, отличающихся временами корреляции. Так как наиболее интенсивным является спектр, соответствующий более быстрому вращению радикала, то параметры спектра, определенные без разделения спектра на составляющие, характеризуют прежде всего именно этот тип комплексов зонда с белком. [c.190]

Пористое стекло Халлера [2196, 219в] и некоторые его применения рассматриваются в следующем разделе. Здесь же отметим только разделение на этом стекле вируса табачной мозаики от вируса кольцевой пятнистости табака и вируса мозаичной болезни южно-африканского боба от бычьего сывороточного альбумина. [c.136]

Для зонного электрофореза ацетатцеллюлозную мембрану (САМ) первым использовал Кон [51]. По мнению Кона, преимущества этого носителя — его однородность и строго определенная пористость. САМ содержит пренебрежимо малое число ОН-групп, загрязненность органическими и неорганическими примесями также весьма мала. В тех случаях, когда сильная сорбция может приводить к образованию на бумаге полосок сзади зон (как, например, при электрофорезе биополимеров) важным преимуществом становится пониженная сорбционная активность САМ. В отличие от бумаги САМ позволяет получить хорошее разделение агфракции сывороточного альбумина, а также инсулина, фибриногена, гистонов, лизоцимов, глико- и липопротеинов и нуклеиновых кислот. После электрофореза меченых соединений остаточная радиоактивность между зонами и стартом исключительно мала. Обесцвечивание фона, если обнаружение проводится путем окрашивания и последующего обесцвечивания, происходит достаточно быстро. [c.293]

С того времени как Дуррум [18] предложил электрофорез белков на бумаге, описано большое число примеров разделения сывороточных белков, ферментов и других растворимых белков. В настоящее время бумага в качестве электрофоретического носителя для разделения белков вытеснена, например ацетатом целлюлозы. Тем не менее бумага все еще используется, поскольку это дешевый, удобный в обращении материал, который легко хранить. Недостатком бумаги является ее сродство к белкам, например к сывороточному альбумину и гликопротеинам, сорбция которых в процессе разделения приводит к образованию удлиненных пятен. [c.341]

На рис. 6.12 показан пример разделения смесей пептидов в длинной колонке с сефадексом 0-100. Фрагмент N из сывороточного альбумина человека состоит из трех пептидных цепей, связанных дисульфидными мостиками. После восстановления, карбоксиметилирования и малеилирования эти три пептидные цепи разделяются на колонке с сефадексом 0-100 в соответствии с их молекулярными массами. Пептид ПЬЦис содержит 162 аминокислотных остатка, цепь 1-АСп — 88 остатков и цепь П-Ала — 36 аминокислотных остатков. [c.383]

Показано, что для разделения сывороточных белков удобны буферы с pH 8,6—9. Для полосок шириной 6 см и длиной 30 см рекомендуется плотность тока 1 мА на 1 см ширины полоски при ионной силе ц = 0,075 и времени разделения 16 ч. При плотности тока 2 мА/см для разделения в барбитуратном буферном растворе с ионной силой ц,=0,05 достаточно 7 ч [86]. Барбиту-ратный буферный раствор (ц=0,075, pH 0,6) можно приготовить путем растворения 2,76 г диэтилбарбитуровой кислоты и 15,45 г диэтилбарбитурата натрия в 1 л воды. Боратный буферный раствор с pH 9,0 готовят путем растворения 8,8 г буры и 0,62 г борной кислоты в 1 л воды. Полоску влажной бумаги промокают между листами фильтровальной бумаги и затем на две трети расстояния от анода до катода наносят образец из расчета около 4 мкл на 1 см ширины. В качестве индикатора миграции можно использовать сывороточный альбумин, окрашенный небольшим количеством бромфенолового синего. После высушивания в термостате при 100 °С электрофореграмму окрашивают, погружая на 10 мин в 1%-ный раствор бромфенолового синего [c.341]

Щелочные боросиликатные стекла можно выщелочить кислотой и щелочью и получить системы с очень однородными по размеру порами в диапазоне 170—2500 А [2196, 219в]. Благодаря узким распределениям по размерам пор пористые частицы стекол обладают уникальными свойствами, позволяющими проводить исследование самого механизма гель-проникающей хроматографии [230], а такн е проводить фракционирование конкретных систем. Обычно можно применять смеси стекол различной степени пористости. На пористых стеклах были проведены разделения искусственных смесей вирусов растений и бычьего сывороточного альбумина [230 а], а также фракционирование образцов полистирола и нолиизобутилена молекулярного веса 10 000-3 400 ООО [2306]. [c.137]

Для создания необходимых градиентов плотности в целях устранения конвекционных потоков или разделения частиц по их плавучей плотности можно использовать и некоторые другие вещества. Тяжелая вода для этой цели непригодна, так как, обмениваясь с молекулами воды гидратной оболочки частиц, она увеличивает их плотность. Имеются данные о применении градиентов плотности коллоидного раствора окиси тория, поливинил-пирролидона, солей цезия и рубидия, тартрата калия (для вирусов), бычьего сывороточного альбумина (для эритроцитов) [2]. В специальных случаях можно использовать сульфолан, триметилфосфат и мочевину [5] например, при исследовании рибосомной РНК, когда требуется, чтобы растворы были оптически прозрачны при 260 нм, или же когда фракцию приходится добавлять непосредственно в сцинтилляционную смесь, или в тех случаях, когда вещества, создающие градиент плотности, не должны искажать определения с орцинолом или дифениламином [5], Однако наиболее часто для увеличения плотности раствора по-прежнему используют растворы сахарозы и солей цезия. [c.176]

Проведенные опыты на амфотерной смоле БАК-6 показали необходимость более тонкого разделения белковых гидролизатов, для чего было-применено фракционирование на сефадексе С-25. На колонну с параметрами 10x70 см вводилось 10 г ферментативного гидролизата сывороточного альбумина. Полученный элюат был разделен на 22 фракции, каждая из которых была изучена по следующим показателям определялся среднечисленный молекулярный вес, определялось число компонентов высоковольтным электрофорезом на бумаге, а также проводилось сравнение выходных кривых с аналитической колонки и определение концевых групп до и после превращения на смоле КМТ. Данные такого опыта частично приведены в табл. 2. [c.174]

Как уже отмечалось, качество разделения при проведении электрофореза в градиенте плотности сахарозы зависит от толщины стартовой зоны, которая в свою очередь определяется конструкцией аппарата и способом введения пробы. Однако даже в идеальных условиях стартовая зона, как правило, составляет несколько миллиметров, и в целях повышения разрешающей силы электрофореза ее желательно уменьшить. Принцип диск-электрофореза в полиакриламидном геле позволяет создавать очень тонкие стартовые зоны путем концентрирования белков, находящихся в исследуемом растворе. Именно поэтому он дает более эффективное разделение по сравнению с зональным электрофорезом в градиенте плотности. С другой стороны, извлечение белков из узких зон в полиакриламидном геле сложнее, чем из растворов с градиентом плотности. Процедура, сочетающая преимущества обоих методов, позволяет получать узкие стартовые зоны и легко выделять разделившиеся вещества из градиента плотности. Шастер и Шрир [1150] описали очень простой прибор для практического воплощения этой идеи. Электрофорез проводили в U-образной трубке. В обоих ее коленах над колонкой с градиентом плотности помещали слой полиакриламидного геля. Зоны, разделенные в геле, мигрировали затем в градиент плотности, где расширялись не более чем в 2—3 раза по сравнению с их толщиной в геле. Эта установка отличается довольно большой емкостью за один прием авторам удалось разделить 50 мг бычьего сывороточного альбумина, и, по их мнению, емкость должна быть еще больше при разделении более сложной смеси белков. [c.32]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология