Аффинная гель-фильтрация

Полученные так суммарные препараты нуклеиновых кислот фракционируют далее, используя более тонкие методы, такие, как хроматография, в том числе аффинная, фильтрация через гели агарозы и сефарозы, распределение в двухфазных полимерных системах, ультрацентрифугирование, электрофорез и др. Большинство этих методов рассмотрено в гл. II и при работе с нуклеиновыми кислотами отличается лишь в деталях. В итоге получают препараты индивидуальных нуклеиновых кислот. [c.190]

И спользованне аффинной хроматографии тем не менее не ограничивается только выделением биологически активных веществ. Уже в 1960 г. Яги и др. [22] описали определение небольших количеств антител с помощью нерастворимых носителей с привязанными антигенами. Применение нерастворимых носителей в количественном радиоиммунном анализе детально рассмотрено в ра.зд. 11.7. Иммобилизованные олигомеры полнтпмидиловой кислоты использовали Эдмондс и др. [11] для количественного определения полнадениловой кислоты. Аффинная гель-фильтрация как микрометод при экспрессных определениях молекулярных масс [c.16]

Обессоливание и смена буфера с помощью гель-фильтрации широко используются в ходе очистки белков и пептидов для освобождения от сульфата аммония или в качестве промежуточной операции, подготавливающей препарат к последующему этапу хроматографии (ионообменной, аффинной или других видов). Если объем раствора белка изл еряется миллилитрами, то рутинную операцию его очистки нередко ведут вслепую . Однажды откалибровав небольшую колонку с сефадексом С-25, последующий отбор фракций, содержащих высокомолекулярные компоненты, производят по объему элюата, нередко просто путем отсчета капель. Соотношение объемов исходного раствора и колонки в этом случае может составлять примерно 1 10. В препаративных вариантах обессоливания, когда желательно максимально использовать объем колонки и избежать разбавления препарата, 5то соотношение можио увеличить до 1 3, контролируя выход хроматографических зон по УсГ-поглощению. Скорость элюции в таких опытах может быть значительной, порядка 20мл/см -ч (скорость продвижения фронта зоны очищаемого вещества по колонке — 20 см/ч). [c.137]

Рис. 5.2. Аффинная гель-фильтрация синтетических смесей (объем образца 50 мкл) бычьего сывороточного альбумина (0,8 мг) с лактатдегидрогеназой (1,85 Е) (о) и малатдегидрогеназой (0,335 Е) (б) [18].

Выбрав таким образом буфер, в него переводят как аффинный сорбент, так и вносимый на него препарат. Последнюю операцию легко осуществить диализом или гель-фильтрацией, а иногда и просто разбавлением. [c.406]

Носители для ионообменной и аффинной хроматографии и гель-фильтрации [c.427]

Часто аффинную хроматографию с успехом применяют на завершающем этапе выделения после частичной очистки с помощью менее специфических рутинных методов, например осаждения сульфатом аммония, гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Специфическое элюирование целевого продукта в этом случае может служить критерием его чистоты, а также тестом на сохранение биологической активности. [c.181]

Эффективность применения моноклональных антител может быть продемонстрирована на примере выделения общего лейкоцитарного антигена (L- -антигена) тимоцитов крысы [7]. На первом этапе с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном лектине чечевицы и гель-фильтрации в присутствии дезоксихолата получают частично очищенный препарат мембранного гликопротеина тимоцитов с молекулярной массой [c.188]

ПЭГ значительно труднее удаляется из белковой фракции, чем соль или органический растворитель. Из-за его полимерной природы он очень медленно диализуется. Разделение на обычной колонке с сефадексом 0-25 также не дает хороших результатов, особенно в случае ПЭГ с мол. массой 20000. Тем не менее остаточные низкие концентрации ПЭГ не мешают проведению многих процедур — высаливание, ионообменную и аффинную хроматографии или гель-фильтрацию можно проводить, не удаляя предварительно ПЭГ. [c.82]

Гель-фильтрация Аффинная адсорбция->- Соль —> Гель-фильтрация [c.268]

Пример 3. Очистка ДНК-полимеразы а из зародыша цыпленка [Yamagu hi et al., 1982]. Аффинной хроматографии здесь также предшествовали четыре стадии ионообменной хроматографии и гель-фильтрация. Сорбция фермента на голубой агарозе в этом [c.421]

Тирозин — аминотрансферазу выделяли методом аффинной хроматографии на пиридоксаминфосфатагарозе (сефарозе 4В) [61]. Фермент элюировали, изменяя состав буферного раствора. Препарат, прошедший на этой стадии 125-кратную очистку, подвергали далее гель-фильтрации на сефадексе G-200. ь-Тирозин-2-оксоглутарат—аминотрансфераза была выделена в виде смеси нескольких изоферментов. [c.19]

Макромолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физико-химическим свойствам лишь незначительно поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помошью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует много времени. Вследствие этого в ходе выделения существенно падает их активность из-за денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. п. Одним из наиболее характерных свойств этих биологических макромолекул является их способность обратимо связывать другие вещества. Например, ферменты образуют комплексы с субстратами или ингибиторами, антитела— с антигенами (против которых получены), а нуклеиновые кислоты, такие, как информационная РНК, гибридизуются с комплементарными ДНК и т. д. Образование специфических диссоциирующих комплексов биологических макромолекул служит основой метода их очистки, известного как аффинная хроматография. [c.9]

Для сорбции лучше всего образец выделяемого вещества растворять непосредственно в буфере, из которого будет производиться сорбция, и, если необходимо, проводить замену состава солей, присутствующих в образце, с помощью диализа или гель-фильтрации. Если вещество, образующее в данных условиях прочный комплекс с иммобилизованным аффинным лигандом, выделяют колоночной хроматографией, то объем образца, вводимого в колонку, может быть любым. Однако, если выделяют аффинной хроматографией вещество с низким сродством к связанному аффинному лиганду, объем наносимого образца не должен превышать 5% удерживаемого объема, для того чтобы предотвратить элюирование выделяемого вещества неадсорбированным материалом. Если выделяют вещество с низким сродством к связанному аффинному лиганду, его элюирование с колонки происходит часто даже без замены буфера. В этом случае выделяемое вещество получают в разбавленном растворе. Для иллюстрации сказанного можно сопоставить хроматографию химотрипсина на сефарозе с присоединенным метиловым эфиром е-аминокапронил-О-триптофана с хроматографией этого же вещества на сефарозе с непосредственно связанным метиловым эфиром О-триитофаиа (рис. 5.4) [8]. Для элюирования химотриисина с нерастворимого носителя, на котором ингибитор укреплен через е-аминокапроновую кислоту в качестве прострапственной группы, необходимо изменение pH, при этом фракция химотрипсина элюируется в виде острого пика. Если ингибитор присоединен непосредственно к нерастворимому носителю, его пространственная доступность понижена, и химотрипсин только замедляет свое движение через колонку. Фермент элюируется в значительно большем объеме, при том же pH, в непосредственной близости к неактивному материалу. [c.264]

Если аффинный лиганд присоедипен к матрице с помощью азосвязи или сложноэфирными связями тиолов или спиртов, с нерастворимой матрицы можно снять комплекс аффинного лиганда с выделяемым веществом, а затем аффинный лиганд отделить диализом или гель-фильтрацией. Этот способ, однако, не позволяет повторно использовать аффинную матрицу. Носители такого типа детально обсуждены в разделе о ковалентной хроматографии (разд. 7.2). [c.272]

Аполкпопротеин Е — эукариотический полипептид, синтезируемый в клетках Е. oli, где он находится в нерастворимом состоянии, но его очищают с помощью аффинной хроматографии в присутствии денатурирующих агентов [32] (табл. 4.20). Для этого используют хроматографию на гепарин-сефарозе с 2 М мочевиной. В этих условиях эукариотический белок, чтобы узнавать лиганд, должен частично принять нативную конформацию. Далее используются еще две стадии очистки, одна из которых — это гель-фильтрация на сефакриле S-300 в присутствии 6 М гуанидинхлорида. Затем после диализа, при котором белок ренатурирует, осуществляется конечная стадия очистки с исполь- [c.124]

Классические методы исследования мембранных белков, в том числе нейрорецепторов, включают практически все биохимические методы с учетом присутствия детергентов (электрофорез, изоэлектрофокусирование, гель-фильтрация, высокоэффективная жидкостная хроматография, аффинная хроматофа-фия и др.). Основным приемом специфического выделения ничтожно малых количеств нейрорецепторов является аффинная хроматография, которая позволила добиться впечатляющих успехов в изучении молекулярных свойств самых разнообразных типов нейрорецепторов. [c.268]

В качестве матрицы в аффинной хроматографии наиболее широко используется агароза. Это очиш,енный линейный содержащий галактозу (рис. 1) аэрогель-ксерогелевый коллоид, выделяемый или из агара или непосредственно из содержащих агар морских водорослей. Агароза характеризуется хорошей гелеобразующей способностью она относительно биологически инертна и поэтому удобна в качестве носителей не только для аффинной хроматографии, но также и для гель-фильтрации. Агар и агароза — не синонимы, и различные агарозные препараты также могут значительно отличаться друг от друга по своим физико-химическим свойствам. Некоторые агарсодержащие морские водоросли приведены в табл. 1. [c.11]

Трисакрилы — серия гелей, производимых фирмой IBF Rea tifs в Париже и распространяемых фирмой LKB. Они представляют собой синтетические гели, применяемые в качестве сорбентов для гель-фильтрации и носителей для ионообменной и аффинной хроматографии. Они получаются полимеризацией уникального мономера Ы-акрилоил-2-амино-2-гидроксиметил- [c.24]

В некоторых случаях мы наблюдали утечку МКА с колонки при элюировании антигена. При этом МКА и антиген после элюирования отделялись друг от друга с помощью гель-фильт-рации. Иногда вместо гель-фильтрации элюат пропускали через аффинную колонку с антииммуноглобулиновыми антителами. В последнее время мы используем антитела, присоединенные к сефарозе L-4B, и совсем не наблюдаем утечки антител, вероятно, благодаря применению перекрестносшитого геля агарозы. Вообще в нашей практике утечка антител никогда не была серьезной проблемой. [c.180]

Иммуноглобулины составляют группу макромолекул, чрезвычайно гетерогенную по биологической активности, заряду и молекулярному весу. Это наиболее щелочные из сывороточных глобулинов, обладающие наименьшей электрофоретической подвижностью (обзор Eisen, 1973). Для их отделения от остальных белков сыворотки используют либо обычные физико-химические методы, такие, как высаливание, ионообменная хроматография, гель-фильтрация и препаративный зональный электрофорез, либо аффинную хроматографию последний метод особенно пригоден для выделения из сыворотки специфических антител. Все эти методы достаточно просты, не требуют большой затраты времени и обеспечивают хороший выход иммуноглобулинов. Иммуноглобулины разных животных различаются по заряду, молекулярному весу и электрофоретической подвижности, поэтому методы фракционирования, пригодные для выделения иммуноглобулинов одного вида, не всегда будут без каких-либо изменений пригодны для глобулинов другого вида в каждом отдельном случае необходима подработка методики. В этой главе дается краткое описание общих методов фракционирования, позволяющих выделять иммуноглобулины большинства видов животных. [c.58]

Следует подчеркнуть, что большинство препаратов иммуноглобулина определенного класса обычно содержит примеси Ig других классов, за исключением IgG, выделенных хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, и IgM, выходящих в первом пике при хроматографии на сефадексе G-200. Поэтому рекомендуется проводить рехроматографию полученных препаратов на той же колонке и в тех же условиях, либо использовать какую-то иную процедуру, например электрофорез в агарозном блоке или гель-фильтрацию. Для той же цели можно применить и аффинную хроматографию на сефарозе с класс-специфической антисывороткой. Миеломные белки классов G, А и М и парапротеины при макроглобулинемии Вальденстрёма удается очистить одноэтапной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе или зональным электрофорезом, поскольку они являются основным компонентом сыворотки. Чистоту каждой фракции иммуноглобулинов исследуют с помощью иммуноэлектрофореза, двойной иммунодиффузии или радиоиммунным методом с класс- или подкласс-специфическими антисывороткамн. Чистые белки хранят при 4°С в присутствии 0,02% NaNs или замораживают растворы с концентрацией 10— 30 мг/мл. [c.72]

В препаратах конъюгатов, полученных ковалентным присоединением фермента к антителам, часто присутствует некоторый избыток свободного фермента. Наличие примеси свободного фермента может заметно снизить чувствительность анализа за счет неспецифического превращения субстрата. Удаление из- бытка фермента дает возможность значительно повысить уровень чувствительности. Так, чувствительность определения поверхностного антигена вируса гепатита В методом ELISA удалось повысить в 50 раз с помощью очистки конъюгата аффинной хроматографией и гель-фильтрацией (Porstmann et ai., [c.181]

Показано, что все три белка аденилатциклазного комплекса (рецепторный, регуляторный и каталитический) являются продуктами отдельных генов. Разделение солюбилизированных белковых фракций, несущих связывающую активность -адренергического рецептора и каталитическую активность аденилатциклазы, осуществлено с помощью гель-фильтрации [2, 3], центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [4] и аффинной хроматографии [c.94]

Равновесие - -N N—С в экстрактах, по-видимому, настолько сдвинуто вправо [52], что возникает серьезная проблема полного разделения С и N. Она осложняется тем, что каталитический белок, взятый отдельно, весьма нестабилен при очистке. Методами гель-фильтрации [51], аффинной хромотографии Л -белка [6] или. аденилатциклазы, имеющей сродство к кальмодулину [53, 54], удается добиться лищь частичного разделения Л -белка и каталитического белка. [c.99]

Некоторые ферменты необыкновенно устойчивы к инактивации, вызываемой любым из факторов, описанных в разд. 6.2. Часто это отмечается даже тогда, когда процедура очистки продолжается в течение нескольких недель. Внеклеточные ферменты отличаются большой устойчивостью потому, что 0Н1И существуют в более жестких природных условиях. В таких случаях быстрота операций не имеет большого значения, если решены проблемы протеолитической инактивации. Но в других случаях, когда стабильность фермента не столь велика, скорость опе раций может быть гораздо важнее, чем разрешегаие, достигаемое на каждом этапе, даже если это означает включение дополнительной стадии очистки для окончательного удаления из препарата примесей. При очистке нестабильных ферментов следует исключать диализ и гель-фильтрацию на медленно фильтрующих средах. Если это возможно, то одна стадия фракционирования должна следовать за другой без длительной подготовки. Так, после солевого фракционирования может идти гель-фильтрация, поскольку на этой стадии удаляется соль и в то же время происходит фракционирование белков. Но после солевого фракционирования нельзя сразу же использовать метод ионного обмена. Его можно применять только в исключительных случаях, когда соль, содержащаяся в осадке, не препятствует адсорбции нужного белка. Непосредственно после стадии ионного обмена невозможно использовать гель-фильтрацию, так как фракции нужно сконцентрировать, — очень редко при элюции с ионообменника получается острый пик, содержащий концентрированный раствор данного вещества (см., однако, обсуждение аффинной элюции в разд. 4.4 и х роматофокуси-рования в разд. 4.3). После фракционирования смеси с помощью органического растворителя может следовать ионный [c.266]

Следует помнить о емкости каждого метода методы осаждения особенно подходят для первого этапа, так как они позволяют работать с очень большим количеством материала. Гель-фильтрация характеризуется умеренной емкостью, если нет возможности использовать колонки огромных размеров. Аффин- ной адсорбции свойственна низкая емкость, однако этот метод позволяет об,работать (большое количество белка, если фактически адсорбируется лишь незначительная его доля. Обессоливание , которое можно провести очень быстро, применяется в следующих удобных для практического использования схемах [c.268]

Солеюе фракционирование —> Обессоливание —>-Ионный обмен или аффинная адсорбция —>-Концентрация с помощью высаливания —>- Гель-фильтрация или [c.268]

Ферментный термистор успешно применяют в качестве инструмента специфического контроля в гель-фильтрации, ионообменной и аффинной хроматографии [11]. Поскольку ферментный термистор можно использовать для непрерывного определения активности ферментов непосредственно в неочищенных пробах, с его помощью можно идентифицировать и локализовать отдельные компоненты сложной хроматограммы, например на начальных стадиях процесса очистки фермента (рис. 29.4). Кроме того, в аффинной хроматографии при элюировании ферментам часто сопутствуют их коферменты, сильно поглощающие в УФ-области, что затрудняет непрерывный контроль за содержанием фермента по УФ-спектрам или спектрофотометрически регистрируемым изменениям концентрации NAD(P)H. Таким образом, в аффинной хроматографии калориметрическое определение активности элюированного фермента имеет определенные преимущества. [c.467]

Путем обработки фрагментов мембраны неионным детергентом (таким, как производное полиоксиэтилена твин-80) удалось солюбилизировать рецепторы ацетилхолина электрического органа. Полученный раствор фракционировали методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Последним этапом очистки была аффинная хроматография на колонке, содержащей ковалентно связанный кобратоксин. В итоге был получен рецептор, очищенный в 10000 раз. Ацетилхолиновый рецептор представляет собой комплекс массой 270 1 Да, состоящий из четырех типов субъединиц. Субъединица 40 ьЩа метится по сродству радиоактивными соединениями, содержащими группу триметиламмония, что указывает на наличие в ней участка связывания ацетилхолина. Удалось получить мембранные пузырьки, содержащие очищенные рецепторы ацетилхолина для этого к раствору рецепторов добавляли фосфолипиды и затем удаляли диализом детергент. Показано, что радиоактивные ионы натрия ( Na "), включенные в процессе реконструирования пузырьков в их внутреннее водное пространство, высвобождаются при добавлении ацетилхолина или его аналогов, например карбамоилхолина (рис. 37.10). Высвобождение ионов натрия блокируют бунгаротоксин и обычные антагонисты ацетилхолина следовательно, оно опосредовано специфическим взаимодействием ацетилхолина со связанным с мембраной рецептором. [c.333]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология