Анализ ближайших соседей

Гидролизующий полинуклеотиды бактериальный фермент, который широко используется для анализа ближайших соседей (гл. 2, разд. 3,4), может осуществлять гидролиз ДНК и РНК до З -нуклеотидов. Установлена трехмерная структура молекулы нуклеазы стафилококков, состоящей из 149 аминокислотных остатков [69—71]. Так же как и в случае панкреатической рибонуклеазы, молекулу нуклеазы стафилококков можно расщепить на два активных пептида (фрагменты, построенные из остатков 6—48 и 49—149), которые, соединяясь, образуют комплекс, обладающий ферментативной активностью [71, 72]. Комплекс образуется даже в том случае, когда от меньшего пептида отщеплены остатки 43—48. Однако остаток 01и-43, который связывает имеющий существенное значение ион Са +, необходим для проявления ферментативной активности [72], так же как и пептидная связь с соседним треонином (Тге-44). [c.124]

Другой метод идентификации полимеров, применимый к исследованию полимеров с близкой нуклеотидной последовательностью, — анализ ближайших соседей 275-2 7 Применение его возможно в том случае, когда исследуемый полинуклеотид может быть получен из радиоактивных предшественников . [c.63]

Анализ ближайших соседей можно проводить и с помощью некоторых методов химического расщепления полинуклеотидов — подробнее см. 69. [c.63]

Полярность цепей ДНК — особенность молекулярной организации ДНК. Две цепи в молекулах ДНК характеризуются противоположной полярностью межнуклеотидная фосфодиэфир-ная связь в одной цепи имеет направление 3 - 5, а в другой — 5 -> 3. Поскольку обе спирали правые, то они без раскручивания не могут быть разделены. Каждая из двух цепей служит матрицей для синтеза новой цепи. Репликация заканчивается образованием двух идентичных дочерних спиралей. Анализ ближайших соседей подтверждает этот механизм. Например, последовательность ТфТ встречается в ДНК с одинаковой частотой, как и АфА, а частота встречаемости ГфГ совпадает с частотой ЦфЦ. Соответствие частот встречаемости остальных последовательностей зависит от того, обладают ли цепи ДНК одинаковой или противоположной полярностью (см. рис. 16). [c.69]

Анализ ближайших соседей в ДНК различного происхождения свидетельствует в пользу противоположной полярности. [c.70]

Из всех этих данных вытекает, что затравочная ДНК определяет не только суммарный состав образующейся РНК, но и пос.ле-довательность оснований в ней. Этот вывод подтверждается также результатами анализа ближайших соседей [21, 22], о котором мы унге писали (стр. 204). Проиллюстрируем его следующим приме- [c.231]

При жестком щелочном расщеплении полимера ЬХ1У остаток нуклеозида, соседний с остатком расщепленного нуклеозида, превращается в нуклеозид-3, 5 -дифосфат рМр. Это можно использовать для анализа ближайших соседей (см. стр. 63). [c.69]

Определение соотношения оснований в полученной РНК путем анализа ближайшего соседа (меченные Р субстраты) при использовании ДНК-затравки с резко отличающимся нуклеотидным составом показало, что образующаяся РНК комплементарна затравочной ДНК- При использовании олиготимидиловой кислоты в качестве затравки из смеси рибонуклеозид-5 -трифосфатов в реакции участвует лишь аденозин-5 -трифосфат с образованием полиадениловой кислоты. Аналогичным образом при использовании ферментативно синтезированного сополимера тимидиловой и дезоксиадениловой кислот (с прямо противоположной последовательностью оснований) в качестве затравки для РНК-полимеразы из Е. oli был получен продукт, содержащий лишь адениловую и уридиловую кислоты (даже в присутствии других нуклеотидов). Щелочной гидролиз (сопровождающийся переносом Р ) показал, что адениловые и урациловые остатки противостоят друг другу, а отсюда затравка определяет как состав, так и последовательность оснований в продукте. (Для частично очищенной бактериальной РНК-полимеразы затравкой могут служить полирибонуклеотиды возможно, при этом функционирует не ДНК-зависимая полимераза, а какой-то другой фермент.) [c.319]

Еще одним доказательством комплементарной природы РНК, полученной на данной ДНК-затравке, служит образование специфического комплекса при нагревании с последующим охлаждением смеси ДНК-затравки и РНК-продукта. При эквимолекулярных соотношениях два полинуклеотида образуют гибридные комплексы, причем ренатурация ДНК исключается благодаря большей стабильности гибрида. Образование гибрида специфично для ДНК-затравки и не происходит с другими дезоксинуклеиновыми кислотами, даже если они обладают сходным нуклеотидным составом. Следовательно, средний нуклеотидный состав, анализ ближайшего соседа и полная комплементарность последовательности — все говорит о доминирующей роли последовательности нуклеотидов в затравочной ДНК в определении природы ферментативно синтезированной РНК- При использовании определенной бактериальной системы Mi ro o us lysodeikti us) не было обнаружено, чтобы матрица и продукт образовывали промежуточные соединения, гибриды (в отличие от ДНК-полимеразы). Далее, после ферментативного синтеза РНК не происходит изменений в плотности матрицы и денатурации (разделении нитей) ДНК- Следовательно, либо двухспиральная ДНК действует как матрица, не раскручиваясь, либо механизм заключается в том, что функционируют небольшие одноцепочечные олигонуклеотидные участки, непосредственно прилега- [c.319]

Анализ ближайших соседей — методический прием, при помощи которого уда- ется определить последовательность нуклеотидов на определенном участке нуклеиновых кислот. Вначале создают систему, содержащую РНК-полимеразу, ДНК-матрицу и все четыре нуклеозидпирофосфата, один из которых, например АТФ, меченый по внутреннему фосфату. Синтезированную РНК затем гидролизуют щелочью, в результате чего радиофосфор оказывается связанным с соседним нуклеозидом. Этот нуклеозид может быть любым из четырех возможных. Далее разделяют образовавшиеся рибонуклеозидмонофосфаты, определяют их радиоактивность и по ней судят о частоте, с которой адениловый остаток следует за данным соседом в цепи РНК. ротом опыт повторяют трижды, каждый раз вводя в систему новый меченый нуклеозидтрифосфат, вследствие чего получают частоты всех шестнадцати возможных пар, сконструированных из ближайших соседей. Найденные таким образом величины весьма хорошо согласуются с соответствующими данными для ДНК-матрицы. [c.37]

Однако такой ход рассуждений весьма наглядно показывает логические и социальные основы дискуссии об отборе. Проведенный недавно анализ (Кларк, 1970) показал, что замещение аминокислот другими, имеющими сходные физико-химические характеристики, наблюдается чаще, чем можно было бы ожидать при случайном замещении. Более того, методом анализа ближайших соседей показано (Субак-Шарп, 1969), что у вирусов частоты дуплетов ДНК распределяются не случайно Кинг и Джукс (1969) и Кимура и Ота (1972) пришли к тем же выводам на основе статистических оценок. Однако последние четыре автора рассматривают эти наблюдения как доказательство в пользу неоклассической гипотезы, потому что их нельзя интерпретировать в том смысле, что естественный отбор направлен против замещений некоторых типов и налагает ограничения на последовательность оснований. [c.232]

В тех случаях, когда продукты рестриктазной реакции имеют полностью спаренные концы, анализ 5 -концевой последовательности дает информацию лишь о структуре половины сайта. В отсутствии сведений об узнаваемом участке, полученных независимыми методами (например, косвенными), для большей достоверности анализ З -коицов является необходимым. Чаще всего для этой цели используется метод анализа ближайших соседей. В таких случаях применение ДНК полимеразы Т4, благодаря присущих ей полимеразной и 3 ->-5 экзонуклеазной активностей, позволяет в присутствии меченных нуклеозидтрифос-фатов ввести 2Р-меченый З -концевой нуклеотид. После гидролиза рестриктов соответствующими фосфодиэстеразами и анализа продуктов реакции определяется ближайший сосед включенного меченого предшественника [99, 166]. В результате такого анализа устанавливается структура З -концевого динуклеотида рестрикционного фрагмента. Обсуждаемый методический подход нашел применение в экспериментах по определению субстратной специфичности рестриктаз Xma I [92] и Hind III [195]. [c.176]

Метод матричного копирования ДНК при помощи полимеразы иногда используется и для анализа рестрикционных фрагментов с 5 -выступающими концами. С этой целью проводится серия опытов, где З -конец фрагмента достраивается полимеразой в присутствии одного меченого и остальных немеченых предшественников. Анализ ближайших соседей позволяет установить не только включаемый нуклеотид, но и последовательность их включения. Этим методом была подтверждена структура узнаваемого участка и определено место расщепления для рестриктаз SalG I [31], Xba I [303] и BamH I [221]. [c.176]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология