Нуклеаза стафилококка

Более подробно влияние лигандов тимидин-3,5-дифосфата (ТОР) и a " было изучено для нуклеазы Т, протеолитического производного нуклеазы стафилококка [94]. Константу равновесия системы нативная конформация — развернутая конформация можно [c.190]

Нуклеаза стафилококков является примером фосфодиэстеразы с малой субстратной специфичностью, поскольку она расщепляет ДНК, РНК и олигонуклеотиды до З -мононуклеотидов [31]. Нуклеаза стафилококков получена в кристаллическом виде определены ее аминокислотная последовательность и трехмерная структура. Необычность фермента заключается в том, что для проявления активности он нуждается в ионах кальция. Ион металла присоединяется к нуклеазе только в присутствии субстрата или ингибитора, например тимидин-3, 5 -дифосфата. Нуклеаза стафилококков действует как эндонуклеаза, но после того, как осуществлены разрывы цепи, она может действовать как экзонуклеаза. [c.145]

Гидролизующий полинуклеотиды бактериальный фермент, который широко используется для анализа ближайших соседей (гл. 2, разд. 3,4), может осуществлять гидролиз ДНК и РНК до З -нуклеотидов. Установлена трехмерная структура молекулы нуклеазы стафилококков, состоящей из 149 аминокислотных остатков [69—71]. Так же как и в случае панкреатической рибонуклеазы, молекулу нуклеазы стафилококков можно расщепить на два активных пептида (фрагменты, построенные из остатков 6—48 и 49—149), которые, соединяясь, образуют комплекс, обладающий ферментативной активностью [71, 72]. Комплекс образуется даже в том случае, когда от меньшего пептида отщеплены остатки 43—48. Однако остаток 01и-43, который связывает имеющий существенное значение ион Са +, необходим для проявления ферментативной активности [72], так же как и пептидная связь с соседним треонином (Тге-44). [c.124]

Как отметили Коттон и др. [73], способность к связыванию фосфатсодержащих молекул с белками — неотъемлемое свойство химии живых систем . Особый интерес представляет природа связывания. Боковые группы остатков аргинина могут образовывать до пяти водородных связей каждая и способны одновременно взаимодействовать с фосфатными группами и с другими группами белковой молекулы. Например, в нуклеазе стафилококков Аг -35 образует связи как с фосфатом, так и с карбонильной группой полипептидной цепи. [c.125]

Антитела можно использовать для идентификации зародышей свертывания. Другой путь поиска следов структуры в несвернутых полипептидных цепях состоит в расщеплении нативных полн-пептидных цепей и в проверке с помощью специфичных антител, который из фрагментов принимает свою нативную конформацию. Большинство из этих экспериментов было выполнено на нуклеазе стафилококка [418 453) они показали, что фрагменты величиной от 17 до 120 остатков свертываются в нативную конформацию с константой равновесия К = [N]/[R]a 10 . Согласно уравнению (3.2), это отвечает невыгодному изменению свободной энергии приблизительно на 4 ккал/моль. В принципе этот метод можно использовать для поиска зародышей свертывания для этой цели необходимо выделить или синтезировать необходимые фрагменты полипептидной цепи [454]. Стабильные фрагменты, которым соответствуют высокие значения К, наиболее вероятно представляют нуклеации свертывания. [c.185]

Важные результаты были получены при исследовании ферментов, в частности рибонуклеазы (Р), нуклеазы стафилококков (Н), лизоцима (Л). На рис. 5.33 показаны резонансы протонов нуклеазы стафилококков в спектральной области, отвечающей ароматическим аминокислотам, при четырех значениях [c.340]

Рис. 5.33. Спектры ЯМР нуклеазы стафилококка при различных pH в спектральной области, отвечающей ароматическим аминокислотам.

Нуклеаза стафилококка — фермент, который состоит из единственной полипептидной цепи, содержащей 149 аминокислотных остатков, и проявляет гидролитическую активность по отношению как к дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК), так и к полимерам рибонуклеиновой кислоты (РНК) [294]. Особенно интересно, что ферментативная активность целиком зависит от присутствия ионов Са(И) в соизмеримых концентрациях при гидролизе РНК и ДНК. Ион Са(П) необходим также для присоединения ингибиторов к [c.114]

Рис. 26. Пространственное изображение структурного окружения иона Са(П) в нуклеазе стафилококка.

Сравнение влияния замещенных ионов металла на активность нуклеазы стафилококка [296] [c.120]

Пептиды Пептид активного центра нуклеазы стафилококков Нуклеаза 120 [c.36]

Из общих соображений следует, что трехмерная структура белка обусловлена не сильными химическими, а слабыми невалентными взаимодействиями атомов звеньев полипептидной цепи. Единственными ковалентными связями в белковой глобуле между далеко отстоящими участками цепи являются дисульфидные связи между остатками цистеина. Наличие нескольких дисульфидных "сшивок", конечно, накладывает заметные ограничения на конформационную свободу белка. Однако нельзя сказать, что 8-8-мостики определяют плотную упаковку молекулы. Далеко не все белки содержат остатки цистеина. Дисульфидные связи отсутствуют, например, в последовательностях миоглобина, гемоглобина, белка вируса табачной мозаики, нуклеазы стафилококка. Между тем эти белки имеют четко фиксированную глобулярную форму и не отличаются меньшей плотностью. [c.232]

Делоншам любезно сообщил нам свои собственные взгляды на механизм, по которому ог-химотрипснн и другие сериновые протеазы могут гидролизовать вторичные амины при стереоэлектронном контроле (рис. 4.7). Петков и др. [119], изучая влияние уходяш,ей группы на реакционную способность анилидов ири гидролизе, катализируемом а-химотрипсином, пришли к подобному же заключению. Кроме того, теория стереоэлектронного контроля была пспользована в приложении к механизму действия рибо-пуклеазы А, нуклеазы стафилококков и лизоцима [120]. [c.256]

РИС. 7-4. Схема, демонстрирующая образование водородных связей между ноиами гуанидииия остатков Агд-35 и Аге-87 нуклеазы стафилококков и 5 -фосфатной группой ингибитора—тимидин-3, 5 -дифосфата в комплексе Е-Ь1+Са + (по Коттону и др. [73]). [c.125]

В глобулярных белках найдены несколько ц с-пептидов, цис-Связи обнаружены во многих циклических пептидах, в особенности со стороны N-конца перед остатками Pro [37, 38]. В глобулярных белковых структурах обнаружено только несколько ис-связей, например перед Рго-93 и Рго-114 в рибонуклеазе S [39], перед Рго-168 в субтилизине [40], перед Рго-116 в нуклеазе стафилококка [Е. Хазен, частное сообщение], перед Рго-8 и Рго-95 вариабельной цепи белка Бенс-Джонса [42] и между Ser-197 и Туг-198 в карбоксипептидазе-А [43]. Молекулы синтетического поли-L-Pro I содержат только цис-съяш. Таким образом, из всех типов стандартных а.минокислот Pro в наибольшей мере способствует образованию цис-чъязя, что согласуется с энергетическими расчетами. Однако, как правило, цис-съяш встречаются крайне редко. [c.35]

Свертывание может происходить значительно быстрее, чем синтез цепи. Свертывание in vitro осуществляется чрезвычайно быстро, по крайней мере для малых белков, не содержащих дисульфидных мостиков. Нуклеаза стафилококка повторно свертывается в течение 1 с [438], а метмиоглобин — в течение 10 с [439]. Если эти величины применимы также и к условиям in vivo, свертывание цепи может происходить по крайней мере в 10 раз быстрее, чем биосинтез аминокислотной последовательности. Дисульфидсодержащие белки, например панкреатическая рибонуклеаза, повторно свертываются за время от 1 до 10 с, если дисульфидные связи не были разорваны в процессе предшеств ющей денатурации [440]. Однако если такие белки развернуты и восстановлены, последующее свертывание цепи (которое включает образование правильной системы дн-сульфидных связей) продолжается при оптимальных условиях в течение многих минут. [c.182]

Повторное свертывание модифицированных белков дает информацию о процессе свертывания. Исследования повторного свертывания нативных белков были дополнены опытами по повторному свертыванию модифицированных белков. В ранних исследованиях [445] было показано, что рибонуклеаза поджелудочной железы, иодинированная по расположенному на поверхности нативной структуры Туг-115, после денатурации теряет способность к повторному свертыванию. Эго показывает, что состояние остатка Туг-115 имеет важное значение для процесса свертывания. Для того чтобы установить, можно ли модифицировать белок (путем расщепления цепи и делеций в последовательности или путем присоединения объемных трупп к боковым цепям) без потери им способности к свертыванию, был проведен ряд систематических исследований нуклеазы стафилококка и панкреатической рибонуклеазы. [c.183]

Особенно интересно сравнить влияние ионов 5г(И) и Ва(П) на нуклеазу стафилококка. Подобно Са(П), для обоих катионов предпочтительны кубические структуры и донорный атом кислорода в качестве лиганда [290]. Данные рентгеноструктурного анализа [33] фермента, ингибированного Ва(П), показывают, что ион Ва(П) смещен на 75 пм относительно центра, занимаемого Са(П). Вероятно, ион 8г(П) смещен от центра связывания Са(П) несколько меньше, поскольку 5г(П) имеет меньший ионный радиус (табл. 3). Эти результаты показывают, что стереохимические требования к координации катиона металла при гидролизе РНК должны несколько отличаться от требований при гидролизе ДНК, поскольку 5г(И) катализирует гидролиз ДНК, но не РНК. Структурные причины уменьшения гидролитической активности по отношению к ДНК в присутствии 8г(И) и исчезновение активности в присутствии Ва(П) нельзя объяснить только на основе кристаллографических данных. Вероятно, геометрические искажения центра связывания Са(П), обусловленные изменением ионного радиуса, передаются области связывания нуклеотида. Эти эффекты могут ухудшать стерическое соответствие субстрата активному центру, что приводит к уменьшению ферментативной активности. Кроме того, необходимо учитывать влияние увеличения ионного радиуса на возможную каталитическую роль молекулы воды, образующую мостик между ионом металла и атомом фосфора в 5 -положении рибозила. [c.120]

Ошибки при использовании изоморфных производных, полученных путем замены иона металла, находящегося в нативном белке, на более тяжелые элементы, могут возникать из-за изменений в структуре металл-лигандных центров при замене металла. Кристаллографические исследования карбоксипептидазы А [29, 67] карбоангидразы С [68, 69] и нуклеазы стафилококка [33] показали что более тяжелый ион металла смещен относительно металла в на тивном белке, как и следовало ожидать, исходя из различных ко ординационных свойств и ионных радиусов соответствующих ме таллов. Из-за вполне вероятного в этих условиях изменения кон фигурации боковых цепей аминокислот, являющихся лигандами отсутствие точного изоморфизма приводит к некоторой ошибке в расчете фаз. Более того, при замене металла следует ожидать, что изменится сольватация и геометрическая структура центра, связывающего металл, как, например, при замене тетраэдрического иона цинка(П) на ртуть(П). Эти изменения также могут привести к утрате точного изоморфизма. Вообще говоря, эта проблема может быть частично решена путем использования фаз, полученных для нескольких изоморфных производных. При расчете электронной плотности вблизи центра связывания металла для производного, в котором тяжелый атом замещает катион нативного белка, могут быть использованы фазы, определенные для других производных. При этом ошибки в определении стереохимии металл- [c.23]

Необычным в случае нуклеазы стафилококка является то, что, несмотря на высокие концентрации Са(П), необходимые для оптимальной активности (вплоть до 0,01 М в зависимости от pH), в растворе в присутствии монофосфонуклеотидов связывается лишь 1 моль Са(И) на 1 моль фермента, тогда как в присутствии ингибитора — тимидин-3 5 -дифосфата (ТДФ)—связываются 2 моля [296]. Однако в отличие от исследований, проведенных для растворов, лишь один центр связывания Са(П) был идентифицирован при рентгеноструктурном исследовании тройного комплекса нуклеаза —Са(И) — ТДФ при разрешении 200 пм [33, 297]. Как указывали Коттон и Хазен [298], это различие может быть обусловлено неодинаковыми условиями рентгеноструктурных и химических исследований. Предполагается [297], что второй ион Са(И) связан между фосфатными группами кольца рибозы и что связыванию препятствует ближайшая боковая цепь соседней молекулы. В отсутствие субстрата ни один из ионов Са(П) с ферментом не связан [295, 296]. [c.115]

Первоначально считалось, что роль Са(П) в ферментативном механизме нуклеазы стафилококка заключается в стабилизации конформации белка, необходимой для ферментативной активности и связывания субстрата в ходе гидролиза фосфата [299]. Проведенный в дальнейшем анализ карты электронной плотности тройного комплекса при высоком разрешении [297] показал, что ион Са(П) может взаимодействовать с -фосфатной группой кольца рибозы в ходе гидролиза эфиров либо через молекулу координированной воды, либо через связанный ион гидроксила. На рис. 26 представлена область активного центра, в которой координирован ион Са(П). На основе интерпретации карты электронной плотности с разрешением 200 пм предложена гексакоординацня иона Са(П) с близким к плоскостному расположением донорных атомов кислорода карбоксильных групп аспартата-19, аспартата-21, аспар-тата-40 и глутамата-43 [297, 299]. Атом кислорода карбонильной группы треонина-41 находится внутри координационной сферы центрального нона Са(И), вероятно, напротив координационного места, занятого молекулой воды. Более сложная вторая координационная [c.115]

Подобная ситуация, по-видимому, реализуется в механизме действия рибонуклеазы. На примере синтетических аналогов переходного состояния субстратов было предположено [307], что в гидролизе рибозилфосфатных эфиров, катализированном рибонук-леазой, участвуют соединения типа переходного состояния субстрата, в которых фосфатная группа напоминает пентаковалентную тригональную бипирамиду. Присоединение и отщепление групп происходит вдоль оси симметрии. Соединения типа переходного состояния субстрата, стереохимия которых аналогична бипира-мидальпой стереохимии фосфата, могут быть представлены с помощью рис. 28 на примере нуклеазы стафилококка и образуются, вероятно, при нуклеофильной атаке кислородным лигандом, координированным ионом Са(П). [c.119]

Следовательно, вызывает удивление тот факт, что нуклеаза стафилококка не проявляет гидролитической активности в присутствии Ьа(1П),У(111) или Еи(П1) [296]. Однако сравнительное исследование [309] влияния катионов лантанидов на активацию а-амилазы — Са(П)-содержащего металлофермента — показывают, что не все катионы лантанидов одинаково эффективны при замещении Са(И). Как указывали Смолка и др. [309], прямое сравнение ионных радиусов редкоземельных элементов с радиусом Са(И) затруднено, поскольку при определении радиусов катионов металлов методами дифракции рентгеновских лучей были использованы различные кристаллические соли и окислы. Кроме того, для комплексов лантанидов с ЭДТА [314, 315], которые могут рассматриваться как аналоги многофункционального центра связывания в белке, характерны высокие координационные числа, вплоть до 10. Дополнительные по сравнению с большинством комплексов Са(П) координационные места обычно заняты молекулами растворителя. Этот структурный фактор может оказаться существенным при связывании лантанидов с нуклеазой стафилококка. [c.121]

Эффективным заместителем иона Са(П) при активации а-амила-зы [309] и при конверсии трипсиногена в трипсин [308] является ион N(1(111). Предварительные исследования [316, 317] показали, что специфическая активность нуклеазы стафилококка с тимидин-3 -фосфат-5 -(п-нитрофенилфосфатом) в качестве субстрата примерно в полтора раза выше в присутствии иона Мс1(111), чем в присутствии иона Са(11). Однако из данных ЯМР следует, что связывание иона N(1(1 И), вероятно, происходит вблизи гистидина-46 и остатка глу-тамата [316, 318]. Для определения различия структурных ограничений при связывании Са(П) и ионов лантанидов нуклеазой стафилококка необходим детальный анализ стереохимии расположения ионов лантанидов относительно соседних аминокислотных остатков. В отличие от термолизина [311] попытки получить лантанид-замещенную нуклеазу стафилококка в кристаллической ( юрме до сих пор не увенчались успехом [299]. Таким образом, эти результаты показывают, что структурные требования при связывании иона [c.121]

Применение акриламидных гелей в аффинной хроматографии в настоящее время весьма ограниченно. Куатреказас [14] показал, что выделение относительно малой молекулы нуклеазы стафилококков можно проводить не только на сефарозе, но и на биогеле Р-300, однако для выделения больших молекул, например р-галактозидазы [84], этот гель мало пригоден из-за низкой пористости. [c.39]

Примером использования ионообменной хроматографии для изучения свойств ферментов может служить работа Таниуши и сотр. [203]. Нуклеаза стафилококка представляет собой фермент, 149 аминокислот которого связаны в единую пептидную цепь без дисульфидных мостиков. Этот свободный фермент легко расщепляется различными протеазами, вызывающими его дезактивацию и деградацию на пептиды и аминокислоты. В присутствии лиганда дезокситимидин-3, 5-дифосфата (рс1Тр) и ионов Са + значительно повышается устойчивость фермента по отношению к денатурации и уменьшается степень его расщепления протеазами. Термолизин вовсе не расщепляет этот фермент, а трипсин, химотрипсин и субтилизин расщепляют его [c.318]

Как мы уже видели на примере дейтерирования специфического остатка Гис в рибонуклеазе (см. разд. 14.2.3), при обмене с ОгО происходит замещение одного протона и исчезновение его сигнала в спектре. Этот метод дейтерирования не всегда пригоден, но замещение протонов дейтерием можно осуществить другими способами. Это позволяет наблюдать некоторые отдельные остатки аминокислот [90—92]. Креспи и сотр. вводили нормальный -лейцин 90, 92], -метионин [92], -фенилаланин [92], -аланин [92] и. .-валин [92] в полностью дейтерированный фикоцианин с, фико-эретрин с и цитохром с путем выращивания сине-зеленых морских водорослей в среде 99,8% ОгО, в которую добавлялись эти немеченые аминокислоты. На дейтерий замещались только а-СН-про-тоны. Широкие резонансные сигналы в характеристических областях протонов боковых цепей каждого типа указывают на то, что в молекуле белка эти аминокислотные остатки могут иметь различное окружение. Маркли и сотр. [91] получили почти полностью дейтерированную нуклеазу стафилококка (за исключением положений 2 и 6 в кольцах остатков Три, Мет и Тир положений С-2 [c.386]

Установлено, что при использовании в реакции иммобилизации 2,5 и 0,5 мкмоль растворимого лиганда на 1 мл сефарозы количество лиганда, присоединенного к бромоцианактивированной сефарозе в описанных выше условиях, в одном случае составляло 1,5 и 0,3 мкмоль/мл сефарозы [16], Емкость приготовленного сорбента устанавливалась путем насыщения известного количества иммобилизованного лиганда чистой нуклеазой стафилококков, Связанный белок элюировали и определяли его количество по ферментативной активности. С матрицами, содержащими 1,5 и 0,3 мкмоль лиганда/мл сефарозы, связывалось 8 и 1,2 мг нуклеазы/мл сефарозы. Зная содержание фосфата в сорбентах и принимая, что фермент связывается с иммобилизованным лигандом в молярном соотношении 1 1 [16], можно рассчитать, что максимальное теоретическое связывание фермента с сорбентом составляет 28 и 6 мг/мл соответственно. При аналитическом элюировании [c.228]

С использованием количественной аффинной хроматографии с зональным элюированием был изучен ряд взаимодействующих систем белок — лиганд и белок — белок. Ниже приведены несколько типичных примеров, показывающих обычные хроматографические результаты, получаемые при изучении моновалентных (например, нуклеаза стафилококков — нуклеотид), бивалентных (например, ТЕРС 15 IgA бивалентный мономер — фосфорилхолин) и кооперативных (например, БФН-П — пептидный гормон) взаимодействующих систем. [c.233]