Рестрикционные фрагменты

Построение генетической карты сцепления человека с помощью метода, основанного на полиморфизме длины рестрикционных фрагментов [c.458]

Рис. 8.7. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов 5 -фланкирующего участка гена инсулина человека. Указано место вставок длиной 1,5 и 3,4 кЬр. Рге — участок, кодирующий аминокислотную последовательность, примыкающую к К-концу проинсулина, которая, видимо, способствует его секреции в эн-доплазматйческий ретикулум В, С и А — последовательности, кодирующие В-цепь, конвекторный пептид и А-цепь инсулина. Заштрихованный участок — интрон (гл. 7).

Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов [c.451]

Рис. 9.17. Метод Саузерна. Молекулы ДНК обрабатывают рестриктазами и образовавшиеся фрагменты подвергают электрофорезу в агарозном геле. Размеры рестрикционных фрагментов определяют по фотографиям геля, окрашенного бромистым этидием. Затем фрагменты денатурируют и переносят на пленку из нитроцеллюлозы с помощью фильтровальной бумаги. Фрагменты ДНК

Для выявления перекрывающихся участков необходимо проанализировать очень большое число космидных клонов, поэтому для поиска меченых рестрикционных фрагментов, общих для пары клонов, используют специальные компьютерные программы. ДНК-отпечаток каждо- [c.464]

Если в вектор встроить рестрикционный фрагмент, содержащий некий экзон А и фланкирующие его интроны, то после трансфекции процессированный транскрипт будет содержать три экзона экзон 1-экзон А-экзон 2. Длина ПЦР-продукта будет больше, чем в тех случаях, когда в векторе нет вставки, когда вставка содержит экзон без функциональных сайтов сплайсинга (донорного и акцепторного) или когда вставка вообще не содержит экзона. Если во вставке присутствует более одного экзона, каждый из которых имеет функциональные сайты сплайсинга, то процессированный транскрипт будет содержать все эти экзоны. [c.476]

Рестрикционный фрагмент, кусок ДНК, вырезанный из молекулы прн помощи рестриктаз. [c.158]

Число известных и охарактеризованных рестриктаз непрерывно растет, так как эти ферменты играют важную роль и в фундаментальных, и в прикладных исследованиях в области молекулярной генетики. Например, полученные с их помощью фрагменты ДНК (рестрикционные фрагменты) можно расположить в такой последовательности, что это даст возможность построить физическую карту генетического материала. [c.469]

Чтобы сопоставить рестрикционную и генетическую карты, нужно сравнить рестрикционные карты ДНК дикого типа и соответствующих мутантов. Связь между генетической и физической картами можно установить на основе одного рестрикционного картирования, если имеются мутанты, сильно изменяющие генетическую карту. Например, маленькая делеция или вставка, нарушающая генетическую карту, вызовет соответственно уменьшение или увеличение размера того рестрикционного фрагмента, в котором она находится. Более протяженная делеция (или вставка) может удалять (или вводить) серии рестрикционных сайтов. Такой пример разобран на рис. 3.4. [c.46]

Точковые мутации труднее локализовать на рестрикционной карте. Иногда они могут изменить сайты-мишени для рестриктирующего фермента. В противном же случае их не удастся определить, так как размеры рестрикционных фрагментов ДНК дикого типа и мутантов оказываются одинаковыми. Поэтому для локализации таких замен оснований часто необходимо определить последовательность оснований в ДНК. [c.46]

Бурное развитие молекулярной генетики человека, начавшееся в 1980-х гг., стало возможным благодаря новаторским идеям Д. Ботштейна, Р. Уайта, М. Скол-ника и С. Дэвиса. Они обратили внимание, что полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) человека порождает полиморфные аллели (маркерные локусы), поддающиеся картированию. Как писали авторы в своей статье, мы хотим предложить новый способ построения генетической карты сцепления человека. В его основе лежит создание при помоши технологии рекомбинантных ДНК случайных однокопийных ДНК-зондов, способных выявлять полиморфные нуклеотидные последовательности при гибридизации с индивидуальными ДНК, обработанными рестриктазой . Более того, они осознали, что, используя сцепление гена того или иного заболевания с маркерным локусом, можно определить хро- [c.458]

Рис. 3.4. В результате делеции исчезает серия рестрикционных сайтов, а рестрикционные фрагменты, расположенные по ее концам, сближаются.

Делеция целиком удаляет фрагменты О и Е, которые имеются среди рестрикционных фрагментов дикого типа, но не у мутанта, несущего делецию. Фрагментов С и Р дикого типа также нет у мутанта с делецией. Однако вместо них у мутанта есть новый фрагмент X, который содержит часть последовательности этих двух фрагментов. Фрагменты, расположенные по обоим концам делеции, А и В слева и О, И и К, справа, одинаково представлены как в диком, так и в мутантном рестрикционных переварах. [c.47]

Рестрикционный фрагмент, соответствующий зонду I,, предпочтительно расщепляется, а фрагмент, соответствующий зонду 2, - нет [c.381]

Прогулка по хромосоме -это инструмент, позволяющий систематически картировать хромосомы эукариотических организмов. Обсуждав-щиеся в этой главе методы работы с ДНК-клонирование рестрикционных фрагментов, анализ сайтов рестрикции в клонируемой ДНК, метод Саузерна, использование клонируемой ДНК в качестве радиоактивного зонда при гибридизации с другими фрагментами ДНК-дают возможность использовать мощные методы генетического анализа, разработанные на прокариотических организмах, для исследования генетической организации эукариот на уровне нуклеотидных последовательностей. Применение этих методов привело к колоссальному прогрессу в нащих знаниях об организации, функционировании и эволюции геномов эукариот. Некоторые из этих открытий мы подробно обсудим в следующих главах, о других можно прочитать в научных журналах. [c.288]

В гл. 9 мы рассмотрели, как при электрофоретическом анализе одной из цепей рестрикционного фрагмента ДНК, содержащей радиоактивную метку на одном конце и случайно расщепленной тем [c.156]

Рестриктазы II типа очень широко испатьзуются в методах генной инженерии для физического картирования ДНК и для выделения участков ДНК в составе того или иного рестрикционного фрагмента. Поэтому в течение ряда лет велся широкий поиск рестриктаз [c.130]

Рестриктазы II типа очень широко испачьзуются в методах генной инженерии для физического картирования ДНК и для выделения участков ДНК в составе того или иного рестрикционного фрагмента. Поэтому в течение ряда лет велся широкий поиск рестриктаз II типа с разной специфичностью (разными сайтами рестрикции). В результате сейчас известно более 350 рестриктаз разных бакте- [c.130]

Анализ реальных образцов ДНК несколько более сложен, поскольку хромосомы встречаются парами (рис. 20.11, В). Однако и в этом случае каждому генотипу (+/+, +/-, -/-) соответствует определенный набор фрагментов, образующийся в результате гибридизации с зондом. Кроме того, для выявления сайта рестрикции на участке 1 можно использовать зонды, гибриди-зующиеся с другими участками ДНК между сайтами А и В (рис. 20.11, Г). Феномен, состоящий в том, что наличие часто встречающегося в популяции измененного рестрикционного сайта приводит к образованию специфического набора фрагментов ДНК, называют полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов (НДРФ). Полиморфные сайты рестрикции образуют маркерные локусы на той хромосоме, где они присутствуют. [c.453]

Отпечаток пальцев (DNA fingerprint) Набор рестрикционных фрагментов ДНК, характерный для данного индивидуума. Для получения отпечатка используют либо гель-электрофорез как таковой, либо в сочетании с ПЦР-амплификацией. [c.555]

Первые прямые данные о перестройке ДНК в процессе развития В-клеток были получены в 1976 г. в экспериментах, в которых ДНК из ранних мышиных эмбрионов, неспособных к выработке антител, сравнивали с ДНК из клеток мышиной миеломы, вырабатывающих антитела. Эти два вида ДНК переваривали рестрикционной нуклеазой и полученные фрагменты гибридизо-вали с радиоактивными последовательностями ДНК, приготовленными путем копирования in vitro V- или С-последовательности молекул информационной РНК для L-цепей, выделенной из клеток миеломы (см. разд. 4.5.3). Как показали результаты этих опытов, специфические V- и С-кодирующие последовательности находились у эмбрионов в разных рестрикционных фрагментах ДНК, а в клетках миеломы-в одном и том же рестрикционном фрагменте (рис. 17-39). Таким образом, у зародыша, где гены иммуноглобулинов не экспрессируются, последовательности ДНК, кодирующие V- и С-области той или иной цепи, локализуются в различных участках генома между тем в клетке миеломы, где уже образуются цепи иммуноглобулинов, эти две последовательности соединены вместе. [c.37]

Сходный метод был применен для пренатальной диагностики -талассемии. При этой гемоглобинопатии -цепь гемоглобина синтезируется либо в недостаточном количестве, либо не синтезируется вообще. При использовании метода определения полиморфизма рестрикционных фрагментов по длине (RFLP) глубоких знаний о молекулярных основах патологических изменений при данном заболевании не требуется. Это по сути метод, отпечатков пальцев , при помощи которого выявляются аномалии, сопутствующие клиническим симптомам, и поэтому он может применяться при лечении многих наследственных болезней [c.344]

Если для вьщеления донорной ДНК (например, методом дробовика ) использовали рестриктазу, той же самой рестриктазой должна быть обработана плазмидная ДНК. Рестрикционные фрагменты донорной ДНК, среди которых есть и фрагмент с нужным геном, смешивают затем с плазмидной ДНК. При смешивании они соединяются липкими концами. Например, липкий конец —ААТТ будет соединяться с комплементарным липким концом —ТТАА. Вначале соединение происходит за счет водородных связей, но после добавления фермента, называемого ДНК-лигазой, образуются фосфодиэфирные связи. [c.222]

Рис. 14.15. Локализация сайтов связывания интегразы фага X с участком POP с помощью метода футпринтинга . Аликвоты, содержащие рестрикционный фрагмент, 5 -конец одной из цепей которого помечен Р, подвергали частичному расщеплению неокарциностатипом (расщепляет по А и Т) в присутствии и в отсутствие интегразы или гепарина. Набор образующихся фраг-МЬнтов анализировали с помощью гель-электрофореза (три левые дорожки). В двух правых дорожках — фрагменты, образующиеся при расщеплении того же меченого фрагмента по пуриновым или по пиримидиновым нуклеотидам методом Максама — Гилберта, для идентификации участков последовательности, защищаемых интегразой. (По Hsu Р. L,

Если на первом этапе клонирования использовался метод дробовика , то бактерии, включившие донорную ДНК, совсем не обязательно будут нести фрагмент ДНК с нужным геном. Донорная ДНК представляет собой смесь очень большого числа рестрикционных фрагментов (в случае ДНК человека — до миллиона). Даже в том случае, когда все эти фрагменты клонируются, нужный ген или участок ДНК будет содержать только один из них или несколько. Смесь клонов, полученных таким путем, называется библиотекой. Библиотеку можно также получить, если на первом этапе использовать обратную транскриптазу и смесь мРНК. Иногда это приходится делать, если нужную мРНК нельзя выделить в чистом виде. Таким образом, в тех случаях, когда клонировался не одиночный ген (синтезированный или считанный с мРНК одного типа), после четвертого этапа получают бактериальные культуры в виде библиотек. [c.224]

Затем проводят радиоавтографию, помещая фильтр на рентгеновскую пленку. Радиоактивное излучение от любой полосы, с которой связался зонд, засветит пленку (рис. 25.32). Многие мутации приводят к делениям в хромосоме, что в свою очередь вызывает уменьщение длины рестрикционного фрагмента. Такой фрагмент более подвижен в геле и при радиоавтографии дает свою отдельную полосу. Таким способом можно вьывить ген серповидноклеточной анемии. [c.260]

Использование электрофореза для разделения рестрикционных фрагментов дает возможность получать рестрикционные карты — последовательности ДНК с нанесенными на них сайтами разрезания для различных рестриктаз. Первая карта была получена для вируса SV 40, содержащего 5423 пары оснований (рис. 1.2). Использовали рестриктазу Hind III, расщепляющую кольцевую ДНК вируса на 11 фрагментов. Порядок их расположения в ДНК был установлен путем исследований наборов обра- [c.28]

Располагая такой информацией, можно локализовать на ДНК биологически важные участки. Так, например, показано, что репликация вируса SV 40 всегда начинается в одном специфическом Hind Ш-фрагменте и продолжается в обоих направлениях. Рестрикционные карты и рестрикционные фрагменты были также использованы для картирования участков ДНК, на которых синтезируются мРНК для вирусных белков. [c.32]

Полиморфизм длины фрагментов рестрикции. Если имеется подходящий ДНК-зонд, то можно обнаружить прямым методом некоторые генетические болезни, возникающие вследствие мутаций (гемофилия, мыщечная дистрофия и др.). Ответственный за болезнь, но неидентифицированный ген может быть обнаружен, если он находится вблизи последовательности ДНК, поддающейся определению. Во всем человеческом геноме примерно одно из 150 оснований является полиморфным, т. е. варьируется у разных индивидуумов. Каждое щестое из этих случайных изменений или порождает, или разрушает участок рестрикции. В результате этого потенциальные участки рестрикции присутствуют вдоль молекулы ДНК с интервалом примерно в 1000 пар оснований. Их наличие или отсутствие у разных людей приводит к тому, что ДНК в процессе рестрикции разрезается на фрагменты разной длины (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов). Если при обследовании членов семьи обнаруживается взаимосвязь между полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов и наследственным заболеванием, делается заключение, что данный участок рестрикции расположен вблизи от гена, ответственного за патологию. В таком случае присутствие данного типа полиморфизма можно использовать для предсказания наличия мутантного гена у другого члена семьи или в ткани плода. Однако использование этой техники для пренатальной диагностики требует предварительного обследования семьи. [c.528]

Подробную рестрикционную карту можно связать с генетической картой. Крупные генетические изменения, такие, как делеции или вставки, можно обнаружить методом рестрикционного картирования. Они приведут к уменьшению или увеличению соответствующих рестрикционных фрагментов. Кроме того, иногда в разультате генетиче- [c.46]

Оказывается, что расщепление до кислоторастворимого состояния только 10% общей ДНК приводит к исчезновению более 50% ДНК активных генов. Следовательно, можно предположить, что при таком расщеплении происходит преимущественная деградация активных генов. Исчезновение активных генов можно подтвердить прямым сравнением судьбы двух генов, активного и неактивного. На рис. 30.8 показано, что происходит с генами (3-глобина и с геном овальбумина в хроматине, выделенном из куриных эритроцитов (в этом хроматине гены глобинов экспрессируются, а ген овальбумина неактивен). Рестрикционные фрагменты, соответствующие генам (3-глобина, быстро теряются, тогда как фрагменты, представляющие ген овальбумина, расщепляются незначительно. (Ген овальбумина фактически деградирует с той же скоростью, что и вся ДНК, хотя это и не следует из показанного на рисунке анализа ранних стадий реакции методом блотт-гибридизации. Противоположная картина наблюдается в ткани яйцевода, в которой преимущественно деградирует ген овальбумина, тогда как глобиновые гены устойчивы, как весь остальной хроматин. Это коррели- [c.382]

Методы секвенирования различаются в первую очередь по способу радиоактивного мечения, и кроме того по способу вьщеления исходного набора фрагментов. Представленная на рис. 9.8 схема основана на методе, разработанном Максамом и Гилбертом. Рестрикционный фрагмент метят радиоактивным изотопом Р в 5 -конце с использованием [у - Р] АТР и фермента, называемого полинуклеотидкиназа. Затем комплементарные цепи разделяют и в них независимо определяют последовательность нуклеотидов. На рис. 9.8 изображена одна цепь звездочка обозначает радиоактивную метку Р на 5 -конце. Четыре отдельных образца этого фрагмента подвергают действию различных реагентов, в результате чего образуется четыре исходных набора фрагментов различной величины. Фрагменты каждого из этих наборов на 5 -конце содержат радиоактивную метку, а на другом конце - определенный нуклеотид (см. рис. 9.8). (При этом образуются также наборы фрагментов с одинаковыми З -кон-цами, однако, эти фрагменты не попадают в поле зрения исследователя, поскольку не содержат радиоактивной метки). Затем четыре исходных набора фрагментов подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле бок о бок . Положение каждого фрагмента в геле можно зафиксировать на обычной рентгеновской пленке. При этом обнаруживается набор полос, каждая из которых соответствует фрагменту определенного размера. Изображенная на рис. 9.8 последовательность фрагментов позволяет прямо с рентгеновской пленки считывать последовательность нуклеотидов, начиная с 5 -конца (т. е. снизу). На рис. 9.9 представлены реальные результаты радиоавтографии геля после электрофореза фрагментов. Как указывается в подписи к рисунку, в действительности нет необходимости в том, чтобы разрезание фрагментов исходного набора производилось по одному и тому же нуклеотиду. [c.273]

Данный способ определения последовательности ДНК наиболее эффективно применяется для рестрикционных фрагментов ДНК, встроенных в двухцепочечную репликативную форму клонирующего вектора, сконструированного на основе одноцепочечной ДНК фага М13. Выделение фаговых частиц, образующихся после трансфекции полученным таким образом двухцепочечным рекомбинантным фаговым геномом, служит непосредственным источником кольцевых одноцепочечных ДНК-матриц, которые используют для определения нуклеотидной последовательности. Описанный метод схематически изображен на рис. 13.9. [c.116]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология