Картирование активных центров

Следует также отметить, что при проведении картирования активного центра ферментов необходимо использовать деполимеразы чистые если не в физическом, то хотя бы в функциональном отношении. Даже малейшие примеси, присутствующие в ферментных препаратах, предназначенных для картирования активного центра, могут значительно исказить результаты эксперимента. Далее, для проведения исследований следует располагать серией структурно-гомологичных олигомерных субстратов с последовательно изменяющейся длиной цепи (предпочтительно от степени полимеризации п, равной двум-трем, до п, равной или превышающей число сайтов в активном центре фермента, обычна до семидевяти. Субстраты должны быть также гомогенными по хроматографическим показателям [5]. [c.39]

Выявление таких данных получило название картирование активного центра фермента. [c.38]

Следует отметить, что нелинейные уравнения типа (31) возникают оттого, что в таком подходе используются только кинетические параметры, анализ которых не позволяет различить позиционные изомеры (например, верхний и нижний для тримера на рис. 9). Это, в свою очередь, приводит к появлению разности в правой части уравнения (31). Если бы авторы измерили также относительные частоты расщепления связей (как в описанном выше случае картирования активного центра Така-амилазы А), то стало бы возможным использовать соотношения (24) и (25), [c.53]

Из этого примера видно, что при картировании активного центра не следует ограничиваться измерением кинетических параметров ферментативного гидролиза, а надо также проводить измерения относительных частот расщепления связей при использовании меченых олигомерных субстратов. [c.54]

Как и в концепции Хироми, основное допущение (в достаточной степени неочевидное) гипотезы Тома при картировании активного центра состоит в том, что свободная энергия связывания (сродство или аффинность) мономерных звеньев субстрата с каждым сайтом является характеристическим показателем сайта и не [c.62]

В связи с этим основная ценность картирования активных центров заключается не в нахождении абсолютных значений показателей сродства Аг, гидролитических коэффициентов ко или инкрементов свободной энергии активации ферментативной реакции при переходе от сайта к сайту АСа, а, по-видимому, в практической демонстрации следующего положения количественный состав продуктов ферментативной реакции в любой момент времени в ходе гидролиза, а также зависимость скорости реакции от степени полимеризации субстрата могут определяться небольшим числом параметров активного центра (числом сайтов, положением каталитического участка) и эффективностью взаимодействия мономерных остатков субстрата с отдельными участками активного центра. [c.75]

Итак, теоретические расчеты авторов работы [14] приводят к выводу о зависимости среднего числа мономерных остатков субстрата, прошедших через активный центр, и среднего числа расщепленных при этом связей не только от строения активного центра, но и от степени полимеризации субстрата. Поскольку эти значения (средние числа) определяют численные величины констант Михаэлиса и максимальной скорости реакции, то Кт и Ут достигают своих предельных величин при степенях полимеризации субстрата существенно больших, чем число сайтов в активном центре фермента. Таким образом, по мнению авторов работы [14], характер зависимости величин Кт или Ут (или их отношения) от степени полимеризации субстрата не может быть использован для определения числа сайтов в активном центре фермента. Здесь следует отметить, что именно на последнем подходе в значительной степени базируется концепция картирования активных центров, разработанная Хироми и сотр. С другой стороны, формальный подход, используемый для расчета степени множественной атаки, приводит к тому, что с его помощью нельзя объяснить специфичность действия эндоглюканаз по отношению к длинным субстратам по сравнению с короткими (см. [14]). Видимо, в основе подобного несоответствия подхода определенным экспериментальным данным опять лежит (как в подходе Хироми) предположение о некой характеристической константе скорости расщепления связей субстрата в активном центре, независимо от числа занимаемых центров и степени полимеризации субстрата. Это общий недостаток многих теоретических концепций о расщеплении полимерных субстратов разрабатываемых в последнее время. [c.101]

Концепции Тома и Хироми о миогосайтной структуре активных центров карбогидраз (см. следующую главу), разработанные в последнее десятилетие, и данные по картированию активных центров во многом прояснили взаимосвязь между структурой активного центра и специфичностью его действия. Стало возможным предсказывать ход кинетических кривых гидролитического расщепления олигосахаридов и состава продуктов их ферментативной л,сструкции на основе числа сайтов активного центра и таких их характеристик, как показатель сродства сайтов к моносаха-ридным звеньям полимерного субстрата. Несмотря на определенную условность допущений, принятых в качестве базовых положений это теории (об этом будет подробно сказано ниже), основ- [c.23]

КАРТИРОВАНИЕ АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ ДЕПОЛИМЕРАЗ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОНЯТИЯ И ОСНОВНЫЕ ДОПУЩЕНИЯ [c.37]

Для большинства опытов по картированию активных центров карбогидраз олигосахаридные субстраты должны быть меченными С по одной из концевых групп. Например, в случае мальтоолигосахаридов введение метки в восстанавливающую концевую группу проводят с помощью циклодекстрин-глюканотрансферазы (КФ 2.4.1.9), действуя на циклогексаамилозу и меченую глюкозу [c.39]

Так как каталитический участок активного центра р-амнлазы расположен между вторым и третьим сайтами, на что указывают данные но составу продуктов ферментативного гидролиза (почти исключительно мальтоза), то величины Лг и Лз не могут быть найдены с помощью онисанного метода картирования активного центра. Однако величину Л, можно найти при анализе состава продуктов гидролиза мальтотриозы под действием а-амилазы. Так, в работе [16] на примере гидролиза мальтотриозы, меченной по восстанавливающему концу, показали, что содержание радиоактивной глюкозы в продуктах реакции в 240 раз превыщает содержание радиоактивной мальтозы. Поскольку мальтотриоза может связываться с активным центром р-амилазы лишь двумя продуктивными способами (I и II, рис. 10), которые приводят соответственно к образованию меченых глюкозы и мальтозы как продуктов реакции, то можно заключить, что способ I — основной продуктивный способ связывания мальтотриозы. Далее, поскольку относительные количества образовавшихся меченых глюкозы и мальтозы соответствуют вероятности Р связывания субстрата в положениях I и II (рис. 10), что согласно рассматриваемой теории имеет прямое отношение к разнице в аффинностях соответствующих сайтов, то можно записать [c.55]

Работа [19] по картированию активного центра эндоксиланазы представляет особый интерес и в том отношении, что в ней была предпринята попытка независимого определения показателя сродства одного из сайтов активного центра, что дает возможность сопоставить эти величины и, таким образом, хотя и косвенно, оценить применимость допущений в теоретической части подхода Хироми. Используя меченные С и ксилозу и ксилобиозу как акцепторы в реакциях трансгликозилирования при гидролизе (соль-волизе) ксилотриозы и экспериментально определяя начальные скорости переноса ксилозы 1 и ксилобиозы Уг на олигосахарид-ный остаток в активном центре фермента, авторы [19] независимо определили показатель сродства второго (от каталитического участка) сайта по направлению к восстанавливающему концу [c.61]

Отправные положения концепции картирования активных центров деполимераз, развитой Тома [1, 2] и впоследствии совместно с Алленом [3—5] независимо от Хироми, в целом согласуются с концепцией последнего. Предполагается, что а) мономерные остатки поли- или олигомерного субстрата, удаленные от его реакционного центра, могут взаимодействовать с активным центром фермента б) сорбционная область активного центра состоит из определенного числа сайтов, геометрически комплементарных мономерным звеньям субстрата в) каталитический участок фермента расположен между двумя определенными сайтами активного центра. Картирование активного центра заключается в экспериментальном определении числа сайтов связывающей области активного центра фермента, вычислении показателей сродства или аффинности каждого сайта по отношению к мономерным остаткам биополимера (обьппю гомополисахарида) и определении положения каталитического участка в активном центре. [c.62]

Как показывают результаты картирования активных центров карбогидраз, в большинстве случаев сайт слева от каталитического участка характеризуется весьма невыгодной энергетикой связывания с мономерным остатком субстрата. Напротив, следующий сайт — справа от каталитического участка — обычно характеризуется сильным сродством к субстрату. Не исключено, что эти особенности взаимодействия полимерных субстратов с активными центрами деполимераз имеют прямое отношение к искажению субстрата поблизости от его реакционного центра при каталитическом расщеплении. Однако, поскольку данные по картированию активного центра получены в определенной степени спорными методами (особенно в отношении сайтов, прилегающих к каталитическому участку), в настоящее время еще рано делать какие-либо обобщения на этот счет. Наконец, сами предположения об искажении реакционного центра полисахаридных субстратов весьма спорны и при рассмотрении реакций, катализируемых лизоцимом, как показано в разделе Б, нуждаются в тщательной проверке. [c.75]

Таким образом, модель действия деполимераз (как эндо-, так и экзодействня), базирующаяся на представлении о множественной атаке, может быть с успехом заменена моделью, исходяпгей из картирования активного центра и базирующейся иа переменной величине ги/фолитичсского коэффициента действия фермента в зависимости от степени полимеризации субстрата и характера связывания его с активным центром. [c.93]

Наличие регуляторного участка на поверхности белкоюй глобулы фермента выявлено в исследованиях реакций совместного окисления аскорбиновой кислоты и ферроцианида калия (рис. 61), а также аскорбиновой кислоты и гидрохинона (рис. 62). Проведенное картирование активного центра пероксидазы на основании кинетических данных индивидуального и совместного окисления субстратов позволило выделить два разных участка в активном центре пероксидазы, связывание в которых субстратов обусловлено природой и индивидуальностью их строения. Осо- [c.138]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология