Рекомбинантная методы

Важнейший метод получения рекомбинантных ДНК основан на способности нуклеиновых кислот быстро восстанавливать свою структуру после нагревания до 100 °С в сильно щелочной среде (pH 13). При нагревании до 100 С комплементарные пары оснований разрушаются и ДНК диссоциирует на две раздельные цепи. Этот процесс назван денатурацией ДНК ( плавлением ). Выдерживание комплементарных цепей при температуре 65 °С приводит [c.109]

Рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы и по синтезируемому ими продукту. Но чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку с использованием методов гибридизации. С этой целью бактериальные колонии выращивают на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на чашку Петри с питательной средой. Далее приготовляют реплики к фильтру с исходными колониями прижимают свежий нитроцел-люлозный фильтр, который затем переносят на чашку Петри с плотной питательной средой, где образуются колонии, идентичные первым. [c.121]

Генно-инженерные методы, в частности технология рекомбинантных ДНК, позволяют создавать новые генотипы и, следовательно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции. Кроме того, появляется возможность целенаправленного изменения генотипа — трансформации — благодаря введению определенных генов. [c.144]

В настоящее время разработаны методы рекомбинации генов в экспериментальных условиях, позволяющие получить новые комбинации генов, не существующие в природе. Синтез рекомбинантных молекул ДНК - новый инструмент в генетических исследованиях, получивших название генной инженерии. В рекомбинации участвуют различные ферменты рестриктазы, экзо- и эндонуклеазы, трансферазы, ДНК-лигазы. [c.61]

Методы получения рекомбинантных ДНК в этой книге не рассматри- [c.19]

Современное руководство по биотехнологии, написанное авторитетными канадскими учеными. В книге подробно изложены основы генной инженерии механизмы репликации, транскрипции и трансляции методы клонирования, амплификации и секвенирования ДНК конструирование рекомбинантных ДНК введение последовательностей-мишеней в геном микроорганизмов, растений и животных, а также практическое применение генной инженерии для получения лекарственных веществ, вакцин, факторов роста, инсектицидов и т.д. Большое внимание уделено генной терапии и связанным с ней морально-этическим проблемам, патентованию биотехнологических продуктов и способов их получения. [c.4]

Каждая глава завершается подробным резюме и списком вопросов для повторения. Мы надеемся, что это поможет усвоить прочитанное. Все ключевые идеи иллюстрируются тщательно подобранными цветными рисунками (всего их более 200) мы убеждены, что один рисунок может сказать больше, нежели тысяча слов. Гл. 1 знакомит читателя с основами молекулярной биотехнологии и некоторыми коммерческими аспектами, а следующие пять глав (гл. 2-6) — с ее методологией. Все вместе эти главы подготовят читателя к восприятию материала всех последующих глав. В гл. 7-12 части II рассмотрены способы получения ценных метаболитов, вакцин, лекарственных веществ и продуктов, использующихся для диагностики, а также методы биодеградации удобрений и пестицидов. В гл. 13 описаны способы крупномасштабного культивирования генетически измененных микроорганизмов с целью получения коммерческих продуктов. Часть. III посвящена молекулярной биотехнологии растений и животных (гл. 14 и 15). Гл. 16 и 17 знакомят читателя с применением технологии рекомбинантных ДНК для идентификации генов человека, ответственных за развитие некоторых заболеваний, и подходами к генной терапии. В последней, IV части рассмотрены вопросы регламентации исследований в области молекулярной биотехнологии, оформления патентов на различные продукты и изобретения. [c.10]

В 1973 г. Стэнли Коэн и Герберт Бойер с сотрудниками разработали способ переноса генетической информации из одного организма в другой. Этот метод, получивший название технологии рекомбинантных ДНК, позволил ученым вьще-лять конкретные гены и вводить их в организм нового хозяина. Технология рекомбинантных ДНК стимулировала развитие различных областей науки, но прежде всего она создала необходимые предпосылки для появления биотехнологии. [c.22]

С развитием технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность более эффективно использовать многие полезные свойства микроорганизмов. В ч. II мы рассмотрим некоторые примеры практического применения микробиологических систем, модифицированных методами генной инженерии. [c.179]

В последнее десятилетие, с развитием технологии рекомбинантных ДНК, появилась возможность создать новое поколение вакцин, не обладающих недостатками традиционных вакцин. Для их разработки применяют методы генной инженерии. [c.228]

Используя технологию рекомбинантных ДНК, можно направленно изменять метаболизм микроорганизмов, вводя в них новые гены или модифицируя уже сушествующие. Основной целью таких изменений является создание рекомбинантного микроорганизма с новой ферментативной активностью, способного превращать существующий субстрат в ценный продукт, который обычно получают только сочетанием химических и микробиологических методов. [c.250]

Химические методы разрушения клеточных стенок включают обработку щелочью, органическими растворителями или детергентами. Если белковый продукт не разрушается при pH от 10,5 до 12,5, то можно без труда и дешево ли-зировать большие количества бактериальных клеток. Например, рекомбинантный гормон роста человека очень просто выделить из клеток Е. соИ обработкой гидроксидом натрия при pH И. После обработки щелочью не остается практически ни одной жизнеспособной клетки, что автоматически решает проблему утечки рекомбинантных микроорганизмов. Обработка органическими растворителями - это простой и недорогой способ разрушения клеток, который используется для выделения ферментов из дрожжей. Однако, чтобы убедиться в том, что в подобранных условиях белковый продукт не денатурирует, необходимо провести предварительное тестирование. Под действием детергентов в мембранах бактериальных клеток образуются поры, через которые белки и другие молекулы выходят из клетки. К сожалению, детергенты дороги, в больщинстве случаев в их присутствии белки денатурируют, а кроме того, они могут загрязнять конечный продукт. [c.365]

Используя клонированные гены, уже картированные с помощью рекомбинантных методов, можно сопоставлять физическую и генетическую карты, как в случае с Е. соИ. Относительно подробные генетические карты построены для таких организмов, как дрожжи, нематода и D. melanogaster, и здесь такое сравнение может оказаться весьма продуктивным. У D. melanogaster корреляция упрощается благодаря наличию обширных цитогенетических данных. Комбинированные молекулярно-генетические карты позволяют клонировать гены, связанные с определенными фенотипом и локусом, но продукт которых неизвестен (например, так был клонирован ген per D. melanoijaster, рис. 6.39). [c.353]

Огромное значение для молекулярной биологии последнего десятилетия имеет развитие генетической инженерии (возникшей в 1972—1973 гг. П. Берг, П. Лобан, С. Коэн и Г. Бойер) и методов работы с рекомбинантными ДНК в сочетании с методами химического синтеза крупных фрагментов ДНК. В результате сделались доступными для исследования индивидуальные гены и регуляторные генетические элементы, было стимулировано изучение ферментов биосинтеза и обмена нуклеиновых кислот. Благодаря этому после 1977 г. были обнаружены мозаичное (экзон-интронное) строение генов, явление сплайсинга и ферментативной активности у РНК, усилители ( энхансеры ) экспрессии генов, многие регуляторные белки, онкогены и онкобелки, мобильные генетические элементы. Возникла белковая инженерия, которая позволяет получать новые, не существующие в природе белки. Молекулярная биология начала оказывать существенное влияние на развитие биотехнологии, медицины и сельского хозяйства. [c.9]

В книге изложены традиционные и новейшие технологии, основанные на достижениях генной и клеточной инженерии. Рассмотрены прогрессивные методы биотехнологии, такие, как получение рекомбинантной ДНК, трансгенных растений и животных, культивирование клеток и тканей, клонирование, обеспечение сверхпродукгивности объектов. Значительное внимание уделено вопросам использования биотехнологических процессов для решения актуальных социально-экономических проблем — энергетических, сырьевых, медицинских, экологических, сельскохозяйственных. Обобщены главные достижения биотехнологии в современном производстве во многих разделах обсуждаются прогнозы ее развития. [c.3]

Технология рекомбинантных ДНК включает набор как новых методов, так и заимствованных из других дисциплин, в частности из генетики микроорганизмов. Эти методы существенно расширяют возможности генетических исследований. Используя технологию рекомбинантных ДНК, получают даже минорные клеточные белки в больших количествах и проводят тонкие биохимические исследования структуры и функций белков, а также осуществляют детальный химический анализ генетического материала. К наиболее важньпм методам биотехнологии рекомбинантных ДНК следует отнести следующие [c.106]

Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя плазмиду pBR322 (см. рис. 5.10), содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бактерий в агар добавляют антибиотик — или ампициллин, или тетрациклин в зависимости от того, какой из генов (Ыа или tet) остался интактным после введения чужеродной ДНК. На такой среде клоны образуют клетки только с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона переносят на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген устойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этих чашках Петри дают клоны только те бактерии, которые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Такая тщательная селекция клонов по устойчивости к антибиотику позволяет идентифицировать рекомбинантные клоны. При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод авторадиографии. [c.121]

Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соедршенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера. Примером может служить метод получения клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК -клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК -клетками. Клетки ТК легко отличаются от клеток TK , поскольку способны расти на средах с ами-ноптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов), гипоксантином и тимидином. Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных бьши использовапы гибриды бактериальных плазмвд с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках Е. соИ и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК -клетки. Анализ мето- [c.125]

Применение методов генетической инженерии в животноводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма повышение продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и др. Животных, несущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, — трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансгенным. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии. [c.127]

В конце 70-х годов XX в. на основе технологии рекомбинантной ДНК получили гормон роста микробного происхождения. Было показано, то ГР оказывает такое же стимулирующее действие на лактацию и рост животного, как и гипофизарный ГР. Гормон роста, полученный с помощью методов генетическсШ инженерии, при крупномасштабном применении вызывал уветачение удоев на 23 — 31 % при дозе 13 мг в день. Разработаны формы препарата пролонгированного действия, позволяющие использовать его один раз в две недели и даже в месяц. При ежедневной инъекции ГР молодняку крупного рогатого скота, свиней и овец удалось увеличить суточные привесы на 20 — 30% при значительном сокращении расхода кормов на единицу прироста. У молодняка свиней с ускорением роста увеличивалось содержание белка и уменьшалось содержание жира в тканях, что повышало качество мясопродуктов. [c.129]

Вышесказанное можно проиллюстрировать следующими примерами. В США осуществлен метод микроинъекции ДНК, отвечающий за экспрессию 3-лактоглобулина, который способен продуцироваться только в молочных железах животных. В Эдинбурге в 1992 г. были вьшедены трансгенные овцы с геном а-1-антитрипсина человека и 3-глобулиновым промотором. Содержание этого белка у разных трансгенных овец составляло от 1 до 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции белка может быть получено около 10 кг трансгенного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы легких. Обычно выход рекомбинантных белков в системах с использованием культуры клеток составляет около 200 мг/л, а у трансгенных животных он может повышаться до 1 л. Следует заметить, что создание клеточных культур и их выращивание в промышленных реакторах, а также выведение трансгенных животных и их обслуживание — дорогие и сложные процедуры. Однако трансгенные животные легко размножа- [c.131]

Как MALDI, так и ионизацию электрораспылением можно легко сочетать с ферментативным расщеплением белков для последующего определения их параметров. После расщепления белка полученная смесь целиком помещается в MALDI-спектрометр и анализируется. В наиболее благоприятных случаях можно определить массу более чем 90% пептидных фрагментов. Этот подход можно использовать для определения изменений в белке, например при определении параметров рекомбинантных белков или для идентификации ковалентно-связанных модификаторов белка. Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением, вследствие того, что она легко сочетается как с ЖХ-МС, так и тандемной масс-спектрометрией, может быть источником еще и дополнительной информации о последовательности аминокислот в белке. При химической ионизации пептид фрагментируется на два комплементарных ряда ионов, которые имеют последовательности аминокислот, начиная с С- и N-терминальных атомов пептида. Тандемная масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением оказывается более экспрессной и находит более разнообразное применение, чем традиционные биохимические методы, такие, как последовательное отщепление аминокислот по методу Эдмана. [c.308]

Молекулярная биотехнология — это увлекательнейшая область научных исследований, с появлением которой произошел настоящий переворот во взаимоотношениях человека с живой природой. В ее основе лежит перенос единиц наследственности (генов) из одного организма в другой, осуш ествляемый методами генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК). В большинстве случаев целью такого переноса является создание нового продукта или получение уже известного продукта в промышленных масштабах. В ч. I мы познакомим читателя с концепциями молекулярной биотехнологии и теми микроорганизмами, которые в ней используются, с основами молекулярной биологии и методологией рекомбинантных ДНК. Будут описаны такие методы, как химический синтез генов, полимеразная цепная реакция (ПЦР), определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Помимо успешного клонирования нужного гена очень важно обеспечить его правильное функционирование в организме нового хозяина, поэтому мы остановимся также на способах оптимизации работы клонированных генов в про- и эукариотических системах. И наконец, мы рассмотрим, как можно улучшить свойства конечных продуктов, модифицируя клонированные гены путем введения в них специфических нуклеотидных замен (мутагенез in vitro). В целом материал, изложенный в первой части, служит фундаментом, который позволяет понять различные аспекты конкретных применений молекулярной биотехнологии. [c.13]

Биотехнология в значительной мере нацелена на получение с помощью микроорганизмов продуктов, имеющих коммерческую ценность. До эпохи рекомбинантных Д НК самым эффективным методом повышения продуктивности организмов был мутагенез с последующей селекцией оптимального штамма-продуцента. Это длительный, трудоемкий, высокозатратный и небезошибочный процесс, позволяющий улучшить лишь немногие из присущих природному организму свойств. В то же время технология рекомбинантных ДНК - это быстродействующий, эффективный, мощный инструмент, обеспечивающий создание микроорганизмов с заранее заданными генетическими характеристиками. Более того, этот инструмент может работать не только с микроорганизмами, но также с растениями и животными. Союз технологии рекомбинантных ДНК и биотехнологии породил очень динамичную, исключительно интересную дисциплину - молекулярную биотехнологию. [c.22]

Трансформация — это процесс введения свободной ДНК в бактериальную клетку. Е. соИ используется в качестве организма-хозяина при работе со многими рекомбинантными ДНК, и чтобы обеспечить проникновение в клетки плазмидной ДНК, их обрабатывают ледяным раствором СаСЦ, а затем вьщерживают при 42 °С в течение 1,5 мин. По-видимому, в результате такой обработки происходит локальное разрушение клеточной стенки. Этот метод дает максимальную частоту трансформации, примерно 10 , т. е. на каждую 1000 клеток приходится одна трансформированная. Эффективность трансформации, которая определяется как число трансформантов на 1 мкг добавленной ДНК, составляет примерно 10 —10. Частота трансформации никогда не бывает 100-процентной, но этот недостаток компенсируется применением схем отбора, позволяющих быстро идентифицировать трансформированные клетки. [c.76]

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. [c.188]

Разработка новых методов профилактики и лечения многих заболеваний человека внесла огромный вклад в рост благосостояния людей в XX в. Однако этот процесс никогда нельзя считать завершенным. Так называемые старые заболевания (например, туберкулез) могут дать о себе знать вновь, как только будут ослаблены профи-лактичес1сие меры или появятся резистентные штаммы. Весьма привлекательной выглядит перспектива применения в качестве терапевтических средств специфических антител их можно будет использовать для нейтрализации токсинов, борьбы с бактериями,, вирусами, для лечения раковых заболеваний. Антитело можно уподобить самонаводящейся ракете, которая либо нейтрализует нарушителя - чужеродный агент, либо, если она оснащена боеголовкой , разрушает специфическую клетку-мишень. К сожалению, несмотря на многообещающие возможности, антитела довольно редко применялись для профилактики и лечения болезней и других патологий. И лишь в последнее время, с развитием технологии рекомбинантных ДНК и разработкой методов получения моноклональных антител и с расшифровкой молекулярной структуры и функции иммуноглобулинов, интерес к применению специфических антител для лечения различных заболеваний вновь пробудился. [c.204]

Для выявления рекомбинантных клонов, синтезирующих экзоглюканазу, использовали иммунный скрининг, позволяющий идентифицировать белок-мишень с помощью специфичных к нему антител секреция белка при этом необязательна. Рекомбинантные клетки лизи-ровали in situ (парами хлороформа), перенесли цитоплазматические белки на найлоновый или нитроцеллюлозный фильтр и провели иммунологический тест. Использованный при этом метод реплик позволил сохранить жизнеспособные клетки для дальнейших исследований. [c.298]

Смотреть страницы где упоминается термин Рекомбинантная методы: [c.72] [c.72] [c.181] [c.19] [c.5] [c.518] [c.110] [c.301] [c.109] [c.119] [c.398] [c.177] [c.116] [c.149] [c.216] [c.217] [c.221] [c.233] [c.270] [c.283] [c.313] [c.362]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология