Инсулин гибридные инсулины

Наблюдение амбулаторных больных подача инсулина обычным способом Подача инсулина гибридной системой с обратной связью [c.573]

Таблица 4.7. Расщепление бромистым цианом гибридных белков Р-галактозидаза-А-цепь инсулина и -галактозидаза—В-цепь инсулина

Выделите А- и В-цепи инсулина из гибридных белков с р-галактозидазой, взяв для начала 24 г влажного осадка клеток (см. табл. 4.7). [c.119]

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. соИ (рис. 5.11). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3 -концу гена фермента -галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. соИ, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента -галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом. [c.133]

Ковалентные семисинтезы осуществляются посредством образования дисульфидных мостиков или пептидных связей. Примеры соединения через дисульфидные мостики — многочисленные комбинации природных и синтезированных химически цепей инсулина в гибридные инсупины. Большая часть используемых на практике се-мисинтезов основана на образовании пептидной связи. [c.218]

В генетической инженерии с целью получения белков в достаточных количествах и с заданными свойствами (например, для генотерапии наследственных и соматических болезней) широкое применение получили эндонуклеазы рестриктазы, катализирующие расщепление молекулы двухцепочечной ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям внутри цепи. Рестриктазы узнают определенные 4-7-членные последовательности, вызывая, таким образом, разрывы в определенных сайтах цепи ДНК. При этом образуются не случайные последовательности, а фрагменты ДНК строго определенной структуры с липкими концами (рекомбинантные ДНК), используемые далее для конструирования гибридных молекул и получения генно-инженерной, биотехнологической продукции (например, инсулина, гормона роста, интерферона, вакцин против вируса гепатита В, СПИДа и др.). [c.481]

В некоторых случаях для достижения высокой плотности культуры и получения больших количеств продукта достаточно проводить ферментацию в обычном периодическом режиме. В одном из экспериментов плазмиду, несушую ген гибридного белка, одним из компонентов которого был пептид инсулина В, помешали под контроль ф-цромотора Е. соИ и вводили в trp -штамм Е. oli] трансформированные клетки [c.363]

Этот ПОДХОД был использован при клонировании гена соматостатина-пт-тщного гормона (14 аминокислотных остатков) из гипоталамуса, регулирующего секрецию инсулина, глюкагона и гормона роста. Ген соматостатина был в этом случае синтезирован химически и присоединен к концу гена 3-галактози-дазы. Два связанных между собой гена были встроены в плазмиду Е. соИ, и полученная рекомбинантная плазмида была введена в клетки Е. oli. В результате такие клетки синтезировали большие количества гибридного белка, состоящего из ковалентно соединенных друг с другом Р-галактозидазы и соматостатина. Такая молекула, представляющая собой гибрид собственного белка Е. oli и белка позвоночного организма, называется химерным белком. Гибрид р-галактозидазы и соматостатина расщепляли по пептидной связи, соединяющей два белка, что приводило к освобождению обладающего биологической активностью соматостатина. [c.988]

В случае полипептидов, не содержащих метионина, для образования составного белка обычно используют метиониновую сшивку, которую в будущем можно расщепить бромистым цианом. Одним из примеров такого подхода служит присоединение р-галактозидазы к А-и В-цепям инсулина [11] соответствующая методика приведена в табл. 4.7. Гены гибридных белков, содержащих А- и В-цепи, клонированы и экспрессируются по отдельности. Перед расщеплением бромистым цианом агрегировавшие белки инкубировали в 6 М гуанидинхлориде и 1%-ном (объемная концентрация) 2-меркаптоэтаноле. Такая обработка должна приводить к развертыванию молекул гибридных белков и ослаблению всех имеющихся внутримолекулярных или межмоле-кулярных дисульфидных связей. Опять же такая предварительная обработка может оказаться необходимой, чтобы связь ме-тионин-Х стала доступной для расщепления. [c.106]

Два Примера белков, состоящих из нескольких субъединиц образование которых удалось осуществить в клетках . соИ, — это инсулин [11] и IgG (антитела к раково-эмбриональному антигену, EA [34]). В обоих случаях гены, кодирующие разные субъединицы, клонировали и экспрессировали независимо друг от друга. А- и В-цепи инсулина синтезировали в виде гибридных белков и были выделены, очищены и S-сульфонированы, как описано в табл. 4.7 и 4.15. S-сульфонированные производные очищали ионообменной хроматографией и обратнофазовой ЖХВД перед восстановлением исходной конформации белков. [c.127]

Второй метод называется методом прямой экспрессии. В этом случае стыковка структурного гена производится в области инициации трансляции с образованием гибридного сайта узнавания рибосомами (рис. 5.3). Такой способ позволяет получать почти естественный чужеродный белок обычно с лишним метионино-вым остатком на МНг-конце полипептидной цепи. Последнее обстоятельство связано с тем, что многие необходимые нам белки человека, такие, как инсулин или интерфероны, синтезируются [c.100]

Проблема внутриклеточной стабильности рекомбинантных белков больше связана с деградацией небольших пептидов, поскольку крупные нативные белки более стабильны в бактериальных клетках. Один из подходов, позволяющих стабилизировать короткие чужеродные пептиды в клетках Е. соН, - включение требуемого пептида в состав гибридного белка. В этом случае последовательность нуклеотидов, кодирующую гибридный белок, соединяют в составе экспрессирующего вектора в одной рамке считывания с бактериальным геном, кодирующим белок (например, геном -галактозидазы). Образующийся в результате экспрессии такого рекомбинантного гена гибридный белок в своем составе содержит в N- или С-концевой части требуемый пептид, защищенный основным белком-носителем от протеолитической деградации. Для отделения пептида от белка-носителя их соединяют друг с другом последовательностью аминокислот, по которой можно провести специфическое расщепление полипептидной цепи. В том случае, если пептиды не содержат метионина, соединение белка-носителя и пептида осуществляют через эту аминокислоту, и отщепление пептида производят с помощью бромистого циана. Такой подход был использован, например для получения рекомбинантного соматостатина, а также А- и В-цепей инсулина. [c.117]