Вектор гетерологичных генов

Принцип действия клеточного дисплея заключается в экспрессии на поверхности клеток гетерологичных белков (белков-пассажиров), которые отсутствуют у данного организма, объединенных в составе гибридной молекулы с помощью пептидного спейсера с полипептидной цепью белка-носителя, обеспечивающего заякоривание всей конструкции в мембране клеток. При этом используют гибридные белки трех типов, в которых белок-пассажир находится на N-конце, С-конце или во внутренней части белка-носителя в виде сэндвича. Для успешного выполнения своих функций белки-носители должны отвечать, по крайней мере, четырем требованиям 1) обладать эффективной сигнальной или транспортной последовательностью, обеспечивающей прохождение гибридного белка через внутренние мембраны клеток 2) проявлять сильные якорные свойства для прочного удерживания белка-пассажира на поверхности клеток 3) должны быть совместимыми с белками-пассажирами, т.е. не дестабилизироваться после объединения с ними 4) демонстрировать устойчивость к протеолитическим ферментам, присутствующим в периплазматическом пространстве или культуральной жидкости. В качестве векторов для генов гибридных белков используют экспрессирующие плазмиды или хромосомы вирусов. [c.350]

Разработка методов генетической инженерии, позволяющих клонировать в составе молекулярных векторов отдельные гены любых организмов и вводить их в гетерологичное окружение клетки-реципиента, открыла прекрасные перспективы для решения такого фундаментального вопроса биологии, как экспрессия эукариотических генов в бактериальной клетке. [c.157]

Таблица 6.2. Активность р-галактозидазы в грамотрицательных бактериях, несущих плазмидный вектор с геном /o ZЕ.соИ и гетерологичным промотором

Искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) предназначены для клонирования больших фрагментов ДНК (100 т. п. н.), которые затем поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы. УАС-система чрезвычайно стабильна. С ее помощью проводили физическое картирование геномной ДНК человека и анализ больших транскриптонов, создавали геномные библиотеки, содержащие ДНК индивидуальных хромосом человека. YA -вектор напоминает хромосому, поскольку он содержит последовательность, функционирующую как сайт инициации репликации ДНК (автономно реплицирующуюся последовательность), сегмент центромерной области дрожжевой хромосомы и последовательности, образующиеся на обоих концах при линеаризации ДНК и действующие как теломеры, обеспечивающие стабильность хромосомы (рис. 7.3). При встраивании чужеродной ДНК в YA может происходить нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате продукт этого гена не образуется, и при выращивании клеток на специальной среде можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые YA -векгоры несут селективный маркер, независимый от сайта клонирования. Несмотря на все преимущества, YA пока не использовались для промышленного синтеза гетерологичных белков. [c.137]

Промотор гена полиэдрина чрезвычайно сильный, а цикл развития вируса не зависит от наличия самого гена. Следовательно, замена последнего геном чужеродного белка с последующей инокуляцией полученным рекомбинантным бакуловирусом культуры клеток насекомого может привести к синтеззу большого количества гетерологичного белка, который благодаря сходству систем внесения посттранс-ляционных модификаций у насекомых и млекопитающих будет близок (а возможно, и идентичен) к нативной форме того белка, который интересует исследователя. Исходя из этого на основе бакуловирусов были разработаны векторы для экспрессии генов, кодирующих белки млекопитающих и вирусов животных. [c.144]

Для вьщеления специфических гетерологичных белков из клеточных экстрактов и из смесей секретируемых белков можно использовать разные подходы. Один из них основывается на присоединении к клонированному гену - без нарущения рамки считывания - сегмента ДНК, кодирующего короткую аминокислотную последовательность, которая специфически связывается с каким-либо химическим элементом, соединением или макромолекулой. Такую конструкцию встраивают в экспрессирующий вектор между промотором и сайтом терминации транскрипции. Короткая аминокислотная последовательность в составе рекомбинантного белка, синтезируемого в хозяйской клетке, играет роль аффинной метки. В одном случае перед клонированным геном был встроен - без нарущения рамки считывания - сегмент ДНК, кодирующий щесть остатков гистидина (Hisg), спейсерный участок, кодирующий семь аминокислот, и сайт [c.149]

Внехромосомные экспрессирующие векторы млекопитающих обычно применяют для синтеза гетерологичных белков, использующихся в научных или медицинских целях. Они представляют собой челночные векторы с сайтами инициации репликации вируса животных и Е. со//-плазмиды. Регуляторные элементы транскрипции обычно происходят из генома вируса животных или из геномов млекопитающих. Для отбора трансфицированных клеток используют доминантные селективные маркерные гены. Некоторые системы отбора основаны на введении в среду возрастающего количества цитотоксичного соединения и позволяют получать клетки, содержащие большое число копий вектора, что увеличивает выход чужеродного белка. [c.155]

В отличие от Agtll гибридные белки с -галактозидазой, кодируемые плазмидами pUR, обычно сохраняют ферментативную активность. Примерно 18 С-концевых аминокислотных остатков -галактозидазы, отсутствующие в гибридных белках, синтезируемых в gll, необходимы для проявления ее ферментативной активности. По нашим данным, гетерологичные фрагменты гибридных белков, включающих -галактозидазу, также более стабильны в клетках Е. соИ, когда соответствующие гены экспрессируются в pUR-векторах, а не в Agtll. Возможно, это свидетельствует о влиянии конформации -галактозидазы на конформацию гетерологичного белкового фрагмента в составе белкового гибрида. [c.140]

Конструирование рекомбинантных молекул иа базе подобных векторов, т. е. введение в них гетерологичных структурных генов, осуществляется с помощью стандартных молекулярногенетических процедур [8, 9]. Аммерер [26] опубликовал интересную методическую статью, посвященную экспрессии в дрожжах генов с использованием промотора add. Эффективность лигиро- [c.218]

Регуляторные части генов, а также продукты их экспрессии, мРНК и белки, распознаются соответствующими ферментными системами организма и обеспечивают упорядоченную экспрессию структурной части гена. При этом регуляторные участки генов и промежуточных продуктов их экспрессии, как правило, высокоспецифичны в отношении своих природных генетических эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, белковых факторов сплайсинга, ферментов, осуществляющих посттрансляционные модификации полипептидов, и т.п.), и чаще всего они не могут эффективно функционировать в гетерологичном генетическом окружении. Очевидно, что при конструировании высокоэффективных экспрессирующих векторов необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры регуляторной части рекомбинантного гена, исходя из того, в каких генетических условиях клонированный ген будет экспрессироваться. Однако не только регуляторные последовательности генов являются препятствием для высокоэффективной экспрессии чужеродных рекомбинантных генов. Как уже было отмечено, структурные части генов про- и эукариот фундаментально отличаются друг от друга по наличию у последних внутри генов интронов. Следовательно, гены эукариот не могут эффективно экспрессироваться в бактериальных клетках, поскольку у прокариот отсутствуют соответствующие системы сплайсинга. Кроме того, у предшественников эукариотических мРНК не может осуществиться в бактериальных клетках и правильный процессинг 3 - и 5 -концевых некодирующих последовательностей. Даже такой [c.106]

Нами было установлено, что эффективность экспрессии в дрожжах и соответственно выход желаемого продукта можно увеличить многократно за счет ряда факторов 1) повышения стабильности вектора при включении в его состав гетерологичного энхансера репликации 2) минимизации размера вектора для повышения числа его копий 3) модификации кассеты экспрессии (индуцибельный промотор, специфичный терминатор, два АТГ кодона начала транскрипции), 4) создания штамма реципиента с ускоренным ростом культуры путем гибридизации неродственных гаплоидных штаммов (Арман и др., 1985 Чеперегин и др., 1990). Использование этих факторов оптимизации позволило создать первые отечественные штаммы дрожжей -высокоэффективные продуценты белка гена поверхностного антигена вируса гепатита В (HbsAg) для получения вакцины (Грановский и др., 1986 Чеперегин и др., 1990). В совместной работе с Институтом вирусологии им. Д.И. Ивановского разработаны условия ферментации штаммов - продуцентов и технология очистки белка, что подтверждено пятью авторскими свидетельствами и патентом (Арман и др., 1989). Вакцина прошла контроль в ГИСК им. Тарасевича, клинические испытания и была передана в производство. [c.71]

Как видим, разработанная система векторов на основе генетических элементов вируса 8У40 обеспечивает широкие возможности для клонирования и изучения закономерностей экспрессии различных генов в гетерологичном эукариотическом окр)жении. Реальна перспектива биотехнологического применения данных работ, так как в некоторых случаях можно достигать высокого уровня продукции полноценного полршептида, структурный ген которого клонирован в векторном варианте вируса 8У40. [c.365]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология