РНК фага оснований в РНК

Как и при всяком методе, связанном с подсчетом, точность определения зависит от числа подсчитанных стерильных пятен. Уже по одной этой причине определение концентрации фага, основанное на подсчете п стерильных пятен, [c.87]

Защита собственного генетического материала с помощью системы рестрикции не всегда эффективна, о чем свидетельствует само существование бактериальных вирусов — бактериофагов. Оказывается, бактериофаги выработали разнообразные тактики борьбы с рестрикцией. Например, для сравнительно небольших фагов известны случаи, когда жесткий отбор на преодоление рестрикции привел к полному отсутствию сайтов узнавания рестриктазы хозяина на фаговой ДНК. Другой способ борьбы с рестрикцией используют некоторые крупные бактериофаги. В состав нх ДНК входит необычное основание, например в ДНК Т-четных фагов Е. соИ [c.132]

Все эти различия становятся легко объяснимыми, если принять, что переход от ранней к поздней стадии репликации ДНК фага Я связан с внесением более или менее случайных разрывов в разные цепи 0-молекулы. Появление при этом молекулы а-типа становится понятным из рис. 143 понятно также, почему при этом не появляются новые потребности в ферментативном обеспечении На ранней и поздней стадиях функционируют, по существу, одни и те же репликационные вилки. Все это дает основание отличать механизм репликации ДНК фага Я от схемы классического разматывающегося рулона. Для удобства будем называть способ поздней репликации генома фага Я способом вторичного разматывающегося рулона. [c.275]

Если репликативная форма ДНК фага X замкнута в кольцо, то ДНК зрелых частиц имеет, как известно, линейную форму. В отличие от линейной ДНК Т-четных фагов ДНК фага X при освобождении из вириона самопроизвольно образует либо кольца, либо линейные агрегаты . Это свидетельствует о том, что ДНК фага Я имеет липкие концы, соединяющиеся друг с другом за счет специфического спаривания оснований. Непосредственное определение нуклеотидной последовательности подтвердило это предположение. На рис. 15-23 показана [c.262]

Как происходит заражение бактерии Т-четным фагом Процесс начинается с присоединения нитей отростка к специфическим рецепторным участкам на поверхности бактерии. Это вызывает ряд конформационных изменений в нитях, базальной пластинке и чехле. При этом из базальной пластинки высвобождается лизоцим и разрушает стенку бактерии. Сокращение чехла начинается с базальной пластинки и далее распространяется к основанию. После того как стержень-проникнет в бактерию, ДНК быстро впрыскивается в клетку хозяина. [c.329]

Предложены модели, в соответствии с которыми узнавание осуществляется с помощью а-спиральных участков белка. Предполагается, что боковые радикалы аминокислотных остатков образуют специфические водородные связи с основаниями в широкой бороздке ДНК. Определение трехмерной структуры четырех регуляторных белков (С1- и СКО-репрессоров Х-фага, САР-белка, репрессора триптофанового оперона) показало, что ДНК-связывающие домены этих белков имеют характерный двухспиральный мотив. Предложены модели ДНК-белковых комплексов, согласно которым одна из а-спиралей (аз) находится в широкой бороздке и взаимодействует с основаниями ДНК, в то время как вторая (аг) взаимодействует с сахарофосфатным остовом ДНК и обеспечивает правильную ориентацию спирали а, в комплексе. Предполагаемые геометрии для четырех специфических ДНК-белковых комплексов не являются полностью одинаковыми положение спирали а, в широкой [c.292]

Евдокимов и Варшавский исследовали плавление ДНК легкой и тяжелой воде в широком интервале значений pH —от 2 до 12 [115]. График зависимости Гпл от pH имеет колоколообразную форму с плато при 80—85 °С (ДНК фага Т2) в интервале pH 4,5—8,5 И резкое падение Гпл при больших и меньших pH (при ионной силе 0,18—0,25). При нейтральных р Н температуры плавления ДНК в НаО и DgO совпадают. Отсюда следует, что водородные связи не определяют стабильность ДНК. В кислой области более устойчива Н-ДНК, а в щелочной — D-ДНК. Различна и зависимость температур плавления Н-ДНК и D-ДНК от ионной силы при низких ее значениях (- 0,01). Этот эффект можно объяснить различиями в степени гидратации, меньшей в DaO. Из экспериментальных данных получены следующие значения АЯ И AS при 37 /о пар Г — Ц АЯ = 8,0, А5 = 23,0 при 40% АЯ = 8,7, AS = 25,4 при 48 /о АЯ = 9,5 ккал/моль пар оснований, AS = 27,4 э. е. Значения для НдО и DgO практически совпадают. [c.520]

Рис. 9.15. Пары БУ—А и БУ—Г. тем, что мы не знаем, какой вырожденный кодон находится в данном месте ДНК. Однако определение аминокислотного состава ряда ревертантов амбер-мутантов (т. е. результатов мутаций, приводящих к бессмысленному кодону УАГ) в белке головки фага Т 4 показало, что замены пар оснований в различных локусах цистрона происходят с разными вероятностями [143]. Мутации ЦАА-)-УАА в локусе г II фага Т4 индуцируются ЫНгОН с частотами, меняющимися в 20 раз в зависимости от локуса ДНК [144]. Сходные факты обнаружены при ультрафиолетовой реверсии этих мутаций [145]. Все приведенные выше факты могут объясняться и тем, что вероятности мутаций внутри цистрона зависят от направления репликации гена, близости контрольных, регулирующих элементов и т. д. Однако Кох получил прямые доказательства влияния соседних пар оснований на мутагенез [146].

Помимо методов внесения мутаций в клонированный ген, основанных на использовании фага М13, были разработаны другие подходы, в [c.166]

Отбор рекомбинантных фагов основан на нарушении а-компле-ментации при встраивании в полилинкер дополнительного фрагмента ДНК. При инфекции клеток вектором образуются голубые колонии, рекомбинанты бесцветны. [c.153]

О том, что Полинг в курсе дела, я узнал из письма Дельбрюка, которое получил, вернувшись из Парижа 18 марта. Теперь это уже не имело значения доказательств в пользу наших пар оснований накапливалось все больше и больше. В Пастеровском институте я получил особенно важные сведения. Там я наткнулся на Джерри Уайетта, канадского биохимика, специалиста по соотношению оснований в ДНК. Он только что провел анализ ДНК фагов Т2, Т4 и Тб. Последние два года [c.123]

В ДНК и РНК также присутствуют и другие основания, но в гораздо меньших количествах. В их число входят, например, 5-метилцитозин (ДНК некоторых растений и бактерий), 5-окси-метилцитозин (ДНК Т-четных фагов, бактериальных вирусов) и 4-тиоурацил (некоторые бактериальные тРНК). [c.106]

За образованием гиперцикла должка следовать стадия обособления от среды — компартментализация. При этом кодирующие единицы объединяются в единую замкнутую цепь, воспроизводящую себя. Эта стадия моделирует уже клеточный уровень. Надо сказать, что Эйген и Шустер, а также Эбелинг провели расчеты, основанные на теории гиперциклов, а опыты Шпигельмана с размножением фага РР в пробирке послужили для ее количественной проверки, причем получился хороший результат. [c.385]

Профаг PI не единственный обладатель системы сайт-специфической рекомбинации, необходимой для стабильного наследования. Такие же системы есть у многих других плазмид. В связи с этим необходимо отметить, что к кольцевым репликонам относится также бактериальная хромосома, при упорядоченной сегрегации которой также могут возникать сложности, аналогичные описанным выше для фага Р1 (см. рис. 70). На этом основании можно предположить возможность наличия сайт-специфической системы реко.мбинации, мономеризующей бактериальную хромосому перед делением клеток. [c.106]

Предполагается, что мозаичная экзон-интронная структура генов, свойственная эукариотам, вероятно, была более древней, чем безынтронная, прокариотическая. В таком случае традиционные филогенетические представления, согласно которым прокариот помещают в основание эволюционного древа, а эукариот — на вершины, должны быть пересмотрены. Геном прокариот, как правило, не содержащий генов с интронами, рассматривается как компактный (рационализированный), образовавшийся в результате потери интронов, например, в результате отбора на скорость репликации. Напротив, предполагается, что мозаичная структура генов определяет эволюционные возможности генома, тогда как прокариоты, утерявшие интроны, представляют собой эволюционный тупик. Заметим, однако, что интроны, удаляемые в результате сплайсинга, изредка обнаруживаются при экспрессии генов в клетках бактерий, например в гене тимидилатсинтетазы фага Т4. [c.194]

Различия между вирусными геномами касаются не только формы молекул ДНК- У некоторых вирусов — пока это известно только для вирусов прокариот, т. е. для фагов,— в состав ДНК входят необычные и модифицированные основания. Классический пример ДНК Т-четных фагов вместо цитозина содержит 5-оксиметилцитозин (ОМЦ), причем к оксигруппе этого основания могут быть присоединены один или два остатка глюкозы (с образованием соответственно гликозил-ОМЦ и гентибиозил-ОМЦ). Геномы некоторых других фагов также содержат необычные основания. В большинстве случаев модифицированным оказывается пиримидин (тимин или цитозин). Ни одна из указанных модификаций не нарушает способности оснований вступать в стандартные уотсон-криковские взаимодействия. [c.262]

При полном расщеплении ДНК фага X рестриктазой Hind П1 образуются фрагменты, содержащие 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 и 165 пар оснований они могут быть разделены с помощью электрофореза в геле агарозы. [c.175]

РИС. 15-14. Предполагаемая схема расположения водородных связей между фрагментом 16S-PHK и участком инициации А-белка в РНК фага R17. Предполагается, что вторичная структура изображенного на этой схеме фрагмента 16S-PHK при физиологических условиях стабильна. На рисунке не показана другая схема расположения водородных связей, соответствующая столь же стабильному комплексу оснований, выступающая петля которой увеличивается до 9 оснований, а четверка оснований UU, расположенная на З -конце, спаривается с AAGG на 5 -конце нижней части стебля [c.232]

Репликаза фага Q способна in vitro синтезировать цепи, полностью комплементарные как плюс-, так и минус-молекулам вирусной РНК. Система, однако, специфична для вирусной РНК и не может копировать никаких других полинуклеотидов. Возможно, что для инициации процесса репликации нужно, чтобы на З -конце имелись определенные последовательности. В пробирке репликация протекает с ошибками, такими, в частности, как преждевременная терминация цепи и неправильное спаривание оснований. В результате происходит образование мутантных форм РНК, что дает возможность получать молекулы РНК, размеры которой будут значительно меньше, чем у вирусной РНК, и которые будут при этом легко реплицироваться репликазной системой фага Q . Была установлена нуклеотидная последовательность одного из таких фрагментов, включающего всего лишь 114 нуклеотидов . [c.245]

Большая часть наших знаний в области биохимической генетики была получена в результате исследования бактериофагов. Интенсивное изучение Т-четных фагов Т2, Т4 и Тб было начато еще в 1938 г. Максом Дельбруком и его сотрудниками. Хотя размеры исследованных ими вирусов малы, тем не менее оказалось, что они относятся к числу наиболее сложно устроенных из известных вирусов (дополнение 4-Д). Генетической информации, содержащейся в одной линейной молекуле ДНК, которая в случае фага Т4 содержит 2-10 пар оснований, достаточно для кодирования примерно 200 генов. Удалось установить положение 60 из этих генов на генетической карте. Ниже мы рассмотрим вкратце метод, при помощи которого это было сделано. [c.248]

КОЙ культуре В-клеток, в которых они реплицировались. В результате происходящей в этих условиях рекомбинаций появились не только фаги с обоими типами мутаций, но также и стандартные фаги, у которых в результате рекомбинации исчезали оба типа мутаций. Поскольку в клетках штамма К растут только рекомбинанты последнего типа, среди миллиардного потомства удается идентифицировать наличие даже единичного рекомбинанта. Предположим теперь, что суммарная длина ДНК фага Т4 составляет 200 000 пар оснований, т.е. на единицу длины карты приходится 286 пар. Частота рекомбинаций между двумя мутациями, равная 0,01%, означает, что в цепи ДНК эти мутации разделены всего лишь тремя парами оснований. Исходя из сказанного, Бензер пришел к выводу, что даже в тех случаях, когда мутации затрагивают основания ДНК, расположенные в непосредственной близости друг от друга, частота ожидаемой рекомбинации между этими двумя мутациями легко может быть определена. [c.250]

РИС. 15-23. Липкие концы ДНК фага н пх образование из репликативной формы под действием эндонуклеазы. Обратите вниманпе на ось локальной приблизительной симметрии второго порядка (местоположение которой обозначено жирной точкой), которая служит специфическим участком взаимодействия с симметричным димерным ферментом. Симметрично расположенные пары оснований заключены в рамки. Точки тт соответствуют этим точкам на генетической карте (рис. 15-22). [c.262]

Скорость репликации в этих ядрах оказалась равной приблизительно 300 000 оснований в одну секунду, причем, согласно данным, полученным в этой же работе, репликационные внлки в хромосомах животных не могут двигаться быстрее, чем со скоростью - 50 оснований в секунду. Таким образом, можно было ожидать, что в хромосоме имеется как минимум 6000 вилок или одна вилка на 10 000 оснований. И такое большое число вилок в действительности удалось обнаружить [191]. Вилки появляются попарно, причем при внимательном изучении оказалось,, что во многих коротких участках содержится одноцепочечная ДНК, т. е. как будто бы одна цепь в вилке реплицируется быстрее другой. Строение одноцепочечных областей между двумя образуюш,ими пары вилками указывает на двустороннюю направленность репликации (рис. 15-29). Репликация в случае Ba illus subtilis также протекает в двух направлениях, однако вилки перемещаются в двух направлениях с разной скоростью [192]. Репликация ДНК фагов X и Т7 также протекает в двух, направлениях [193], тогда как митохондриальная ДНК мыши реплицируется лишь в одном направлении [194]. [c.274]

Недостаточно обоснованные выводы о встречаемости нуклеозидов могут оказаться некорректными. Так, помимо восьми основных нуклеозидов (1) — (8), большинство классов нуклеиновых кислот, столь сильно различающихся между собой, содержат, как было показано, в большем или меньшем процентном отношении модифицированные нуклеозиды. Длительное время было известно, что 5-метилдезоксицитидин образуется в гидролизатах ДНК растений и животных [7] полагают, что каждая система ферментов рестрикции бактерий содержит метилазу, которая метилирует специфические остатки оснований ДНК хозяина в последовательности, узнаваемой рестрикционной эндонуклеазой [7], давая таким образом появление модифицированных нуклеозидов из бактериальной ДНК. Фаговые ДНК часто содержат большие количества модифицированных нуклеозидов и очень возможно, что нас еще ожидает много неожиданностей по мере определения состава нуклеи новых кислот других фагов [7]. [c.70]

Важнейщим путем интенсификации биосинтеза антибиотиков является выведение и использование штаммов продуцентов с повышенной антибиотической активностью. Получение таких штаммов стало возможным благодаря разработке и широкому применению методов экспериментального мутагенеза. Из физических факторов в селекционной работе эффективно используются ионизирующие излучения (рентгеновы лучи, -у-лучи, быстрые нейтроны и др.), ультрафиолетовая радиация, температура, ультразвук. Высокую частоту наследуемых изменений вызывают у микроорганизмов также многие химические соединения, которые предложено объединять (Никифоров, 1965) в следующие группы ингибиторы предшественников нуклеиновых кислот аналоги азотистых оснований, включающиеся в нуклеиновые кислоты алкилирующие соединения окислители, восстановители и свободные радикалы акридиновые красители. Из факторов биологической природы в селекции продуцентов антибиотиков часто применяются фаги и антибиотики. [c.179]

Экспериментальные данные, появившиеся вскоре после работ [42, 44], подтвердили модель с раскручиванием. Воспользовавшись формальдегидным методом (см. стр. 524), Косаганов и соавторы исследовали комплекс ДНК из фага Т2 с РНК-полимеразой из Е. соИ в присутствии всех четырех нуклеозидтрк-фосфатов [38]. Формальдегидный метод позволяет обнаружить дефекты в ДНК в количестве 1 на 10 000 пар оснований. В полной системе была установлена концентрация дефектов в ДНК, равная (6 2) 10 , что соответствует среднему расстоянию между двумя дефектами в 1600 500 пар оснований. В исходной ДНК и в комплексе ДНК — РНК-полимераза в отсутствие НТФ концентрация дефектов менее Ю и расстояние между двумя соседними дефектами превышает 10 пар оснований. Инактивация полимеразы нагреванием также уменьшает число дефектов до 10-. Позднее, пользуясь модифицированным формальдегидным методом, те же авторы обнаружили расплетание ДНК уже на стадии ее связывания с ферментом. [c.569]

Рис. 8.1. Олигонуклеотид-направленный мутагенез. Одноцепочечную ДНК фага М13 (плюс-цепь), несущую ген-мишень, отжигают с комплементарным синтетическим олигонуклеотидом, содержащим одно основание, не комплементарное соответствующему основанию исходной ДНК. Олигонуклеотид служит затравкой для синтеза ДНК, а М13-вектор с встроенным геном — матрицей. Репликацию катализирует фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 Е. oli. Синтезированную полноразмерную цепь замыкает в кольцо ДНК-лигаза Т4. Образовавшимися двухцепочечными молекулами трансформируют Е. соИ. Часть фаговых частиц содержит ДНК дикого типа, часть — мутантную ДНК.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК Основной недостаток олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза с использованием фага М13 -большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага М13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК. Это позволяет обойтись без переноса Интересующего исследователя гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагенеза - обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину в середине последнего заменен один нуклеотид (рис. 8.3). Клетки Е. соИ трансформируют вектором, несущим ДНК-мишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеоти- [c.161]

В результате этих экспериментов были получены две рекомбинантные эндонуклеазы рестрикции Fokl. Одна из них расщепляла ДНК фага X в том сайте, который и ожидался, а вторая -в ожидаемом сайте и - в меньшей степени - в двух других сайтах. Это не удивительно, поскольку цинковые пальцы распознают в основном два из трех оснований триплета. Хотя эти рекомбинантные ферменты пока нельзя использовать в лаборатории, описанный подход создания уникальньгх эндонуклеаз рестрикции представляется весьма перспективным. [c.174]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология