Эксплантаты, культивирование

Итак, если к полезному гену присоединить маркер (а это сегодня не представляет труда) и ввести в Т-ДНК агробактерии, далее всю работу возьмет на себя природа при совместном культивировании эксплантатов с агробактерией произойдет трансформация, и молекулярному селекционеру останется отобрать (по экспрессии гена-маркера) нужные варианты. [c.101]

Основополагающие эксперименты, проведенные в 1907 году, включали использование небольших фрагментов ткани или эксплантатов. В наше время культуры обычно готовят из клеточной суспензии, полученной путем диссоциации ткани. Большинство клеток, образующих ткани многоклеточных организмов, в отличие от бактериальных клеток не способны расти в суспензии. Для роста и деления им необходима твердая поверхность. Вначале, когда метод культивирования только появился, в качестве механической опоры использовали сгусток плазмы, но в настоящее время его обычно заменяют поверхностью пластиковой культуральной чашки фис. 4-39). Клетки очень различаются по своим потребностям некоторые из них способны расти или дифференцироваться только в том случае, если культуральная чашка покрыта компонентами внеклеточного матрикса, например коллагеном. [c.203]

Регенерация обычно с трудом происходит из трансформированных недифференцированных тканей, полученных из культивируемых более нескольких месяцев клеток суспензии, а еще с большим трудом из каллусов, полученных из протопластов [3, 28]. Таким образом, прежде чем осуществлять трансформацию любой разновидности растений, чрезвычайно важно определить наиболее чувствительный эксплантат. Для. многих культурных видов главной трудностью остается трансформация клеток, способных регенерировать побеги ( органогенез ) или способных к эмбриогенезу, и поэтому большинство методов разработано в результате экспериментов на модельных системах культуры тканей, таких, как табак и петуния. Для ясности большинство из рассматриваемых ниже методик основано на использовании именно таких модельных систем. В целом все основные манипуляции с культурой ткани должны быть действенными для успешной разработки системы трансформации конкретных видов растений. Информация относительно культивирования тканей многих видов содержится в следующих литературных источниках [4, 24, 25, 26, 70, 83]. [c.105]

Чашки Петри диаметром 9 см, содержащие 25 мл агаризованной среды для поддержания жизнеспособности эксплантатов во время совместного культивирования с агробактериями (например, MSO и RD) и для удаления бактерий после трансформации (например, MSO+ x [250 мкг/мл] и RD+ [c.111]

Во многих случаях при культивировании растительной ткани легче регенерировать побеги из эксплантатов органов, чем из полученных на основе протопластов тканей или устоявшихся [c.119]

Малые гомогенные эксплантаты могут быть представлены как отдельными клетками или протопластами, так и встречающимися в суспензионных культурах небольшими клеточными агрегатами, образованными различным числом клеток. Популяции таких эксплантатов можно использовать в экспериментах по трансформации, а для манипуляций с ними применять методы, разработанные для бактерий. Эта технология часто упоминается как метод совместного культивирования и включает инкубацию агробактерий совместно с многочисленными попу- [c.140]

Чередование культивирования эксплантатов в среде и газовой фазе [c.217]

Недавно для длительного культивирования взрослых тканей человека, таких как эпителий бронхов и молочной железы, пищевод и шейка матки [20—23], был успешно использован новый метод, обеспечивающий попеременное экспонирование ткани в среде и в газовой фазе. Для этого эксплантаты прикрепляются к дну пластикового культурального сосуда н покрываются средой. Сосуды затем помещают в камеру, заполняемую соответствующей газовой смесью. Камеру устанавливают на специальную платформу, которая в ходе культивирования качается с определенной -скоростью. [c.217]

II. Утром в день получения эксплантатов пропитайте 10 ыл стерильной дистиллированной воды или раствора Хэнкса слой ваты или фильтровальной бумаги, используя градуированную пипетку, и установите часовые стекла над отверстиями в подложке. Эти отверстия обеспечат прохождение света при работе с бинокулярной лупой и облегчат макроскопическое обследование эксплантата в ходе культивирования. [c.221]

Многие эксперименты, связанные с изучением морфогенетических изменений и дифференцировки клеток, не требуют длительного культивирования, и ответы на поставленные вопросы могут быть получены в течение 3—7 дней. В этих случаях можно не менять среду. Если эксперимент требует более продолжительного культивирования, то следует переносить эксплантаты на свежий агаровый гель каждые 5—7 сут. Свежий гель делается в новой камере при соблюдении тех же пропорций агара, сыворотки и среды. [c.227]

II. Проведите дальнейшую подготовку ткани, освободите ее от жира, стромы и подлежащих мышц и разрежьте на фрагменты подходящих для культивирования размеров. Эти размеры оказываются разными для разных тканей. Так, эксплантаты бронхов имеют размер 2 см , молочной железы и шейки матки 0,5—1 см , а пищевода 1 см . [c.239]

I. Б конце периода культивирования выньте полоски с эксплантатами из среды и ополосните холодным раствором Хэнкса. [c.242]

В 1925 г. А. А. Максимов предложил метод двойного покровного стекла. По своей сути он имеет много общего с методом висячей капли, но в отличие от него стекло с кусочком в плазменном сгустке покрыто сверху другим стеклом (или слюдяной пластинкой) большего размера, что обеспечивает стерильность меньшего стекла. При разжижении плазменного сгустка достаточно промыть маленькое стекло с эксплантатом в солевом растворе, нанести каплю плазмы и эмбрионального экстракта и снова продолжать культивирование. [c.10]

Плазменные культуры обеспечивают поддержание кроветворения в эксплантатах эмбриональной печени в течение лишь непродолжительного времени. Этот период зависит от вида донора, стадии эмбриогенеза, на которой берется материал для культивирования, и, возможно, от состава питательной среды (в частности, от добавления гомологичного эмбрионального экстракта). [c.18]

Изменения в составе кроветворной ткани, происходящие в эксплантатах костного мозга по мере культивирования, могут иметь различные объяснения. Для того чтобы проследить превращение одних клеточных форм в другие, культуры в плазменном сгустке не являются удобной моделью. Поэтому ко многим данным о клеточных трансформациях в таких культурах следует относиться с осторожностью. Так, на основании морфологических наблюдений возможными источниками гигантских клеток в культурах костного мозга считают жировые клетки, гистиоциты, миелоциты, а также и другие элементы костного мозга. [c.19]

Возникает вопрос об источниках клеток, населяющих культуры костного мозга на второй фазе. Происходят ли эти клетки только за счет размножения макрофагов-гистиоцитов, входящих в состав исходного эксплантата, или же в их образовании принимают участие и гемопоэтические элементы, трансформирующиеся в условиях культивирования. [c.23]

Человеческие фибробласты in vitro сохраняют онтогенетические и генотипические свойства донора, в связи с чем широко используются для диагностики многих наследственных болезней. В обзоре описаны источники для получения культур, взятие биопсии, получение эксплантата, культивирование клеток, способы пересевов, криокоисервация клеток. Библиогр. 10 иазв. [c.318]

ИХ стерильное культивирование после удаления агробактерий с помощью обработки антибиотиками остаются простейшим методом введения генов во многие двудольные растения. Это обусловлено тем, что на поверхности зараженного растения образуются опухоли (в случае заражения А. rhizogens — на корнях) и злокачественные клетки легко распознать (рис. 2.1) и перевести эксплантаты в культуру in vitro. Опухоли корончатых галлов большей частью образованы трансформированными клетками, которые способны расти на питательной среде, не содержащей фитогормонов, и, следовательно, обогнать в росте любые нетрансформированные клетки, присутствующие в исходной опухоли. Однако онкогенные клетки корончатых галлов [c.88]

Подходящими эксплантатами считаются целые стерильные проростки, эксплантаты проростков (например, гипокотили, семядоли, листья и корни), эксплантаты выращенной в теплице рассады, более зрелые или размножаемые in vitro растения (например, корень, стебель, лист, черешок, фрагменты цветковых и запасающих органов). Состав используемых сред в какой-то мере зависит от вида растения и типа эксплантата. Например, для роста проростков или эксплантатов побегов может подойти среда, используемая для поддержания культуры побегов того же вида растения. С другой стороны, фрагменты запасающих тканей (клубней, главных корней) часто сохраняют жизнеспособность в течение нескольких недель при культивировании на агаризованной среде, содержащей только неорганические соли. У большинства видов растений корончатые галлы или косматые корни развиваются на больших эксплантатах, культивируемых на простых средах, не содержащих фитогормонов. Главное требование к ростовой среде, используемой при трансформации и развитии опухоли, заключается в том, чтобы она обеспечивала жизнеспособность эксплантата при ограниченном образовании каллуса. При использовании небольших эксплантатов в состав среды можно включить и микродобавки ростовых веществ, чтобы сохранить эксплантат и обеспечить ограниченное деление окружающих рану клеток во время инкубации с агробактериями. Проблему выживаемости эксплантата можно решить, [c.108]

Приступить к эксперименту по трансформации с помощью неонкогенных векторных систем следует после выбора подходящих эксплантатов и условий инокуляции и селекции, позволяющих получать резистентные к антибиотику каллусы с помощью онкогенных штаммов агробактерий и угг-помощников (описанных в разд. 2.2). Необязательно, что условия, дающие эффективную трансформацию определенного эксплантата с помощью онкогенной векторной системы, подойдут для трансформации с помощью неонкогенных векторов. Неонкогенные ткани гораздо чувствительнее к условиям культивирования, поскольку в них, очевидно, не проявляются физиологические и ростовые свойства ткани корончатых галлов и косматого корня. И в этом случае подходящие комбинации угг-систем, хозяйских штаммов агробактерий и селективных генов можно установить только эмпирически. [c.117]

Трансформированные побеги можно регенерировать через стадию каллуса. В этом случае с помощью культивирования на соответствующей селективной среде на эксплантатах получают каллусы. Затем из установившихся трансформированных тканей (каллусных или суспензионных культур) индуцируют индивидуальные побеги путем эмбрио- или органогенеза на среде для регенерации. Стратегия включает, во-пер-вых, регенерацию в присутствии селектирующего агента и, во-вторых, без селектирующего агента с последующим укоренением в его присутствии или скринингом на экспрессию маркерного гена. [c.118]

В последующие 5—20 дней периодически наблюдают за эксплантатами побегов, следя за появлением признаков образования корней, хлороза и формирования новых листьев. Некоторые нетрансформированные побеги часто успевают пускать новые побеги прежде, чем становятся хлоротическими, а впоследствии погибают только через несколько недель культивирования на среде, содержащей селективный агент (например, канамицин). Однако в большинстве случаев только трансформированные побеги успешно укореняются на среде, содержащей канамицин. Следует еще раз отметить, что часть побегов, полученных из листовых дисков, нередко укореняется в присутствии селективного агента такие неудачи в порядке вещей. [c.126]

Одна из важнейших задач при разработке методики генетической трансформации любых видов растений заключается в идентификации подходящих эксплантатов, из которых может произойти эффективная регенерация побегов. Обычный подход—это определить эксплантат и комбинации сред, которые стимулируют регенерацию растения путем органо- или эмбриогенеза. Невозможно предсказать условия, приводящие к регенерации побегов у каждого вида, поэтому изложенная ниже методика дает только общие принципы поиска. Как правило, если литература по культивированию какого-либо отдельнога вида отсутствует, можно попытаться осуществить регенерацию [c.130]

Рис. 2.10. Влияние происхождения эксплантата на регенерационную способность эксплантатов проростков льна. Различные эксплантаты после четырех недель культивирования на MSD4X2 Л — корни, 5 — гипокотили, S — семядоли.

Приведенные выше соображения в равной степени относятся к выделению трансформантов из клеточных суспензий, совместно культивированных с Agroba terium tumefa iens (разд. 2.10), и популяций протопластов, трансформированных путем прямого поглощения векторной ДНК (гл. 3). Описанные методы можно применять для селекции трансформированных колоний во всех экспериментах, подразумевающих использование больших популяций малых гомогенных эксплантатов. [c.156]

Обычно клетки из первичных эксплантатов здоровых тканей проявляют себя как нетрансформированные в течение первых генераций после выделения. Некоторые клетки остаются такими в течение 50 генераций и более. Такие нормальные клетки требуют обязательного присутствия в определенных количествах высокомолекулярных белков, гормонов и факторов роста даже при культивировании в улучшенных средах. Трансформированные клетки могут расти без ростовых факторов при условии обеспечения незаменимыми неспецифическими добавками. Появляется все больше данных о том, что опухолевые клетки способны стимулировать собственную пролиферацию, продуцируя аутокринные ростовые факторы. [c.43]

В понятие органная культура входит получение эксплантата и выращивание in vitro органа или части органа, в котором различные компоненты ткани, такие ак паренхима и строма, а также их анатомическая взаимосвязь и функционирование сохраняются в культуре таким образом, что эксплантирован-ная ткань близко напоминает родительскую in vivo. Миграция изолированных клеток на периферии эксплантата подавляется специальными условиями культивирования, и образующиеся новые отростки состоят из дифференцированных структур. Так, в изолированных железах образуются новые железистые структуры, а на периферии эксплантатов легочной ткани развиваются новые мелкие бронхи. Они состоят из альвеол, окаймленных секреторным кубическим или цилиндрическим бронхиальным эпителием. [c.214]

Этот метод имеет ряд ограничений. Эксплантаты часто разжижают. сгусток и погружаются в него, что ухудщает снабжение ткани кислородом. Сложность среды исключает проведение биохимических исследований, и длительность культивирования при использовании этого метода оказывается ограниченной. И хотя во многих экспериментах положительные результаты могут быть получены в течение короткого времени, рещение дру- [c.222]

Вместо миллипоровых фильтров можно использовать поли-карбонатные мембраны (Nu leopore Sterilin). Они прозрачны, не содержат детергентов, поэтому эксплантаты, растуш,ие на таких мембранах, можно осматривать в ходе культивирования. Таким способом можно культивировать целые органы, например эмбриональные молочные железы. Ткань можно фиксировать и исследовать непосредственно на мембранах, что позволит избежать приготовления срезов. [c.231]

Преимущества органной культуры заключаются в поддержании целостности ткани и межклеточных взаимодействий таким образом, органная культура наиболее приближается к ситуации in vivo по сравнению с другими известными методами культивирования. Количественная оценка действия лекарств на клетки в органной культуре затруднительна хотя бы из-за значительной клеточной гетерогенности "эксплантатов. Так что, хотя этот метод и нашел широкое применение в исследованиях чувствительности к гормонам соответствующих тканей, использова- ше органных культур в исследованиях чувствительности к лекарствам остается ограниченным. Эта проблема обсуждена в недавно опубликованной обзорной статье [12], а также в гл. 7 этого сборника. [c.259]

Исследования Fell положили начало новой области культивирования —органным культурам (рис. 2), в которых эксплантат помещается на границе с газовой фазой [c.12]

Гемопоэз на ранних стадиях культивирования в эксплантатах костного мозга кролика в плазменных культурах был изучен Ra hmilewitz и Rosin в 1944 г. В их исследовании поставлен вопрос о том, происходят ли в плазменных культурах костного мозга размножение и дифференцировка кроветворных элементов. Через 24 часа после эксплантации соотношение незрелых костномозговых клеток к зрелым изменялось в пользу зрелых по сравнению с исходным материалом. Поля зрелых эритроцитов располагались в эксплантате обособленно от зон миелоидиого кроветворения. Через несколько суток кроветворение угасало, а эксплантат приобретал соединительнотканный характер. [c.19]

Клетки-предшественники для колоний фибробластов, возникающих в культурах, находятся в исходном костном мозге вне пролиферативного пула. Они постепенно входят в S-период спустя 28 часов после эксплантации. Действительно, при введении в культуры костного мозга Н -тимиди-на на первые 4—72 часа с дальнейшим культивированием на среде с холодным тимидином оказалось, что индекс метки фибробластов, появляющихся в 3—5-дневных культурах, зависит от продолжительности того первоначального периода, в течение которого культуры велись на среде с Н -тими-дином (И. В. Кейлис-Борок и др., 1971). Если Н -тимидин присутствовал в среде не дольше первых 28 часов, фибробласты оставались немечеными, хотя значительная часть гистиоцитов в таких культурах содержала метку. Если Н -тимидин находился в среде в течение первых 31 часов и дольше, то индекс метки фибробластов был 30% и выше. При этом повышение индекса метки соответствовало удлинению срока контакта культур с Н -тимидином. Максимум метки (98%) достигается при культивировании в присутствии Н -тимидина в течение 60 часов. Эти данные показывают, что включение метки в клетки-предшественники для фибробластов не происходит в первые 28 часов культивирования и что клетки-предшественники вступают в пролиферативный пул постепенно после 28 часов. Важным условием для вступления клеток-предшественников в состояние пролиферации оказалось их прикрепление к поверхности субстрата. При инкубации взвешенных в среде клеток костного мозга в присутствии Н -тимидина в течение даже 2 суток фибробласты метку практически не содержали (И. В. Кейлис-Борок и др., I97I). Отмеченное свойство существенно отличает клетки-предшественники для фибробластов от клеток-предшественников для гистиоцитов. Их пролиферация начинается с момента эксплантации, а максимум пролиферативной активности в эксплантатах костного мозга приходится на первые сутки культивирования. [c.29]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология