Последовательность сайтов узнавания

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6-12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом. [c.85]

В то же вре.чя многие регуляторные белки эукариот, как и у прокариот, составляют ничтожную долю всех белков. Регуляторные последовательности эукариотических генов иногда удалены от промотора на значительное расстояние (энхансеры, см. гл. X, раздел 2) и расположены впереди или позади него. Эго затрудняет поиск белков, узнающих определенные последовательности ДНК-ДИК в хроматине свернута в спираль с шагом около 80 и.о., и сайт узнавания может быть составлен из фрагментов разных участков, разнесенных в первичной структуре на эту величину. Поэтому изучение и моделирование механизма узнавания ДНК в хроматине требуют разработки совершенно новых подходов. [c.250]

Наименование фермента Источник получения Сайт узнавания в последовательности ДНК [c.190]

Рестриктазы делятся на несколько типов по характеру расщепления нуклеотидной последовательности. Рестриктазы I типа узнают сайт рестрикции, но расщепляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов) от сайта узнавания. Такие рестриктазы невозможно использовать для решения генно-инженерных задач. Рестриктазы III типа похожи на рестриктазы ] типа, они гидролизуют ДНК на расстоянии 20—35 н. п. от сайтов узнавания и также довольно редко используются практических целей. [c.26]

Ферменты, используемые для получения рекомбинантных молекул,— рестриктазы II типа. Основной характеристикой таких рестриктаз является то, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Обычно рестриктаза II типа узнает определенную последовательность на ДНК и гидролизует ее внутри последовательности сайта рестрикции. Сайты рестрикции рестриктаз II типа представлены симметричными при повороте на 180° последовательностями — палиндромами [c.26]

Для изображенной ниже последовательности ДНК, где N обозначает основания, не узнаваемые ферментом, ЕсоШ вносит разрыв в свой сайт узнавания (выделен красным цветом) в точках, отмеченных вертикальными стрелками [c.238]

Распределение сайтов узнавания фермента носит случайный характер по отношению к геному в целом. Поэтому обработка эукариотической ДНК рестриктазами приводит к образованию множества фрагментов. При электрофорезе в геле эти фрагменты образуют пятно, в котором неразличимы отдельные полосы (за исключением ряда полос, соответствующих некоторым повторяющимся последовательностям, рассмотренным в гл. 24). [c.243]

Клонирование фрагментов, полученных путем механического дробления, сопряжено с рядом технических трудностей в вектор легче встроить рестрикт. Однако сложность такого встраивания состоит в том, что сайты рестрикции могут находиться в неудобных местах, например в середине гена, который надо клонировать. Один из способов преодоления этой трудности состоит в использовании более чем одной рестриктазы, т.е. в повторении эксперимента с различными ферментами, сайты узнавания которых занимают разные положения. Но это требует дополнительного времени, и при работе с длинной последовательностью бывает сложно найти фермент, не разрезающий ее. [c.243]

Другая возможность состоит в том, что в состав гена входит промежуточная последовательность (или последовательности), имеющая сайт узнавания рестриктазы. Действительно, наличие каждого интрона, содержащего такой сайт, приведет к образованию дополнительного фрагмента. (Противоположный результат, когда получают один фрагмент, не доказывает отсутствия промежуточной последовательности, поскольку интрон не обязательно содержит сайт рестрикции. Это также не исключает возможности существования небольшого числа расположенных рядом копий.) [c.251]

Точечные мутации аг5-элемента приводят к тому, что область кора длиной 14 п.н. становится точкой начала репликации. Кор содержит каноническую последовательность. Не исключено, что именно она является сайтом узнавания для белка, участвующего в проявлении функции точки начала репликации. Если в осуществление этой функции вовлекаются и другие последовательности, то у каждого из известных ам-элементов они разные. Извест- [c.404]

Палиндромные последовательности, которые распознаются рестрицирующими эндонуклеазами типа Пив которых происходит расщепление молекулы ДНК, называются сайтами узнавания. Помимо рестриктаз, гидролизующих (расщепляющих) полинуклеотидную цепь с образованием линюгх концов, существуют рестрик-тазы, которые вносят разрывы в цепи строго друг против друга с образованием фрагментов ДНК с тупыми концами (рис. 4.3). Сайты узнавания могут состоять из четырех, пяти, шести, восьми или более пар нуклеотидов (табл. 4.1). От длины сайта узнавания зависит частота его распространения в молекуле ДНК в большинстве случаев используют рестриктазы, узнающие тет-ра- и гексануклеотиды. [c.53]

Рестриктазы второго типа узнают палиндромные последовательности-последовательности, обладающие центральной симметрией и считывающиеся одинаково в обе стороны от оси симметрии. Рестриктазы третьего типа, напротив, узнают асимметричные сайты. В табл. 9.1 представлены сайты узнавания для нескольких рестриктаз. Как указано стрел- [c.267]

Используемые при клонировании рестриктазы выделяют из различных прокариот. Всего было получено более ста пятидесяти их разновидностей. Они отличаются друг от друга тем, что узнают и расщепляют разные нуклеотидные последовательности, Сайты узнавания для большинства ферментов, используемых в генетической инженерии, представляют собой палиндромы из 4, 5 или б нуклеотидов. Расщепление происходит с образованием либо тупых (как в случае Alul), либо липких (способных к комплементарному связыванию) концов (как в случае BamHl см. рис. 7,6). Неспаренные нуклеотиды липкого конца оканчиваются З -гидроксильной или 5 -монофосфатной группировкой в зависимости от фермента. [c.317]

Семейство векторов pSequoia с теми же чертами фагмидных векторов пятого поколения, но характеризующихся отсутствием в векторной последовательности сайтов узнавания для некоторых тетрануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз [c.225]

Подобное получение серии субклонов с требуемыми размерами укороченной вставки при раздельном лигировании элюированных из геля образцов ДНК и их независимой трансформации возможно только с использованием вектора, в нуклеотидной последовательности которого отсутствуют сайты расщепления для тетрануклеотидных рестрикционных эндонуклеаз, каковым и является фагмидный вектор pSequoiaT12, поскольку при наличии в векторной последовательности сайтов узнавания фермента, используемого для недорестрикции, образуется чрезмерно сложная картина электрофоретического разделения, в которой выбрать необходимые полосы не представляется возможным. [c.278]

Практически все виды бактерий синтезируют но одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндонуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктаза-ми), поскольку их основная функция состоит, но-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов. [c.266]

Если слияние гена-мишени с фрагментом ДНК, кодирующим сигнальный пептид, не приводит к эффективной секреции белкового продукта, приходится использовать другие стратегические приемы. Один из таких приемов, с успехом примененных в отнощении интерлейкина-2, основывался на слиянии гена, кодирующего интерлейкин-2, с геном, кодирующим полноразмерный предшественник мальтозосвязывающего белка, а не только его сигнальную последовательность, и разделении этих генов сегментом ДНК, кодирующим сайт узнавания для фактора Х . Когда такой химерный ген включили в плазмидный вектор и использовали его для трансформации Е. соИ, в периплазме хозяйской клетки обнаружили в большом количестве химерный белок. Обработав его фактором Х , получили функциональный интерлейкин-2. [c.126]

Как следует изменить нуклеотидную последовательность ДНК, чтобы, сохранив аминокислотную последовательность, удалить сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции BamHl Считайте, что первый нуклеотид сайта узнавания совпадает с первым нуклеотидом кодона. Каким методом это можно осуществить [c.198]

Сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции Ват Н1 имеет последовательность GGAT , которая кодирует дипептид Glj—Ser. Для того чтобы нарушить сайт узнавания, достаточно заменить один из нуклеотидов. Учитывая, что Gly кодируется четырьмя, кодонами GGN, а Ser — кодоном U N, где N - любой из четырех нуклеотидов, то достаточно [c.444]

Недостаток этого метода состоит в сложности выделения встроенного фрагмента из клонированной химерной плазмиды, поскольку в исходном векторе после встраивания чужеродной ДНК не стало сайта узнавания рестриктазой. Встроенная последовательность с каждой стороны окружена участками спаренных последовательностей ро1у(с1А) ро1у(с1Т). При этом методе могут исполь- [c.239]

На рис. 20.8 показано, что если промежуточная последовательность не содержит сайта узнавания ни для одной используемой рестриктазы, длина соответствующего фрагмента изменяется. Наличие интрона означает, что между двумя сайтами рестрикции, расположенными по обе стороны от него, имеется большее расстояние в гене, чем в мРНК. Поэтому и длина соответствующего фрагмента в расщепленном рестриктазой гене увеличивается. [c.248]

С другой стороны, если в промежуточной последовательности имеется сайт узнавания фермента, в него вносится дополнительный разрыв. Поскольку этот разрыв вносится только в ген, но не в последовательность мРНК, то при расщеплении гена получаются два фрагмента вместо одного, образовавшегося из мРНК. Это показано на рис. 20.9. [c.248]

При картировании с использованием нескольких рестриктаз могут быть получены результаты и того, и другого типа. Разрывы, вносимые одними ферментами, не попадают в промежуточную последовательность тогда длина соответствующих фрагментов увеличивается. При использовании других ферментов из той же промежуточной последовательности будут образовываться дополнительные фрагменты. Объединяя вместе эти данные, мы видим, что при создании полной рестрикционной карты гена, содержащего интроны, карта каждого конца гена соответствует карте каждого конца последовательности мРНК. Но в некоторой точке внутри гена карты различаются там имеется дополнительная область, содержащая ряд сайтов узнавания, отсутствующих в мРНК. Разрешающая способность метода рестрикционного картирования позволяет обнаруживать участки гена размером до 20-30 п. н. [c.249]

Образование сайта узнавания для РНКазы III путем спаривания оснований между 5 - и З -концами нуклеотидной последовательности каждого предшественника означает, что каждая реакция процессинга может осуществляться только после того, как. синтезировались два конца последовательности-мишени (п16 или н23). In vivo, HO всей вероятности, РНК связывается с некоторыми рибосомными белками до осуществления процессинга. Однако известно, что это не является необходимым условием для его протекания, поскольку выделенная из клеток 30S-PHK может быть расщеплена РНКазой III in vitro. Таким образом, способность 5 - и З -концевых участков к спариванию сохраняется как в отсутствие, так и в присутствии рибосомных белков. [c.313]

Все рестрикционные эндонуклеазы бактерий узнают специфические, довольно короткие последовательности ДНК и связываются с ними. Этот процесс сопровождается разрезанием либо в самом сайте узнавания, либо в каком-то другом, что определяется типом фермента. Подробно мы анализировали реакцию разрезания при обсуждении перспектив ее использования для картирования или реконструирования ДНК in vitro (гл. 3 и 19). Теперь мы рассмотрим вопрос о том, как выполняют эти ферменты свои природные функции. [c.432]

Бифункциональный фермент из трех субъединиц Двусторонняя и асимметричная (например, ТОАЫвТОСТ) последовательность Неспецифичный, примерно на расстоянии 1000 пар оснований от сайта узнавания Взаимно исключающие [c.433]

Сайты узнавания ферментов ЕсоВ и ЕсоК-это структуры, состоящие из двух частей. В обоих случаях первая часть представлена специфической последовательностью из трех пар оснований, отделенной у фермента ЕсоВ восемью парами, а у ЕсоК-шестью парами оснований от специфической последовательности в четыре нуклеотидные пары. Расстояние между двумя частями сайта узнавания указывает на то, что обе они находятся на одной стороне ДНК последовательность промежуточной области, по-видимому, важной роли не играет. Заметим, что оба сайта узнавания несимметричны. Одаако каждый из них действительно несет на каждой из, цепей по одному аденину для метилирования, как пок з о звездочками в последовательности узнавания ферментов ЕсоВ. [c.434]

Эндонуклеаза НО, называемая также YZ-эндонуклеа-зой, вносит ступенчатый разрез в области Z1, находящейся на расстоянии трех пар оснований от сайта связывания YZ. Она не разрезает мутантные локусы МАТ, которые не способны переключаться. Последовательности, содержащие менее И пар оснований мишени после делегирования, также не разрезаются, что свидетельствует об относительно большой протяженности сайта узнавания нуклеазой. Вероятно он не встречается ни в одном другом участке генома. [c.489]

Для ферментов типа II последовательность представлена лишь в одной цепи комплементарную последовательность можно достроить. Вертикальная линия обозначает положение, в котором разрываются фосфодиэфирные связи. Звездочки указывают основания, которые могут быть метилированы соответствующими ферментами модификации. Специфический сайт узнавания Dpn I содержит метилированный аденин ( А), тогда как сайт МЪо I содержит неметилированное основание. Msp I узнает указанную последовательность независимо от метилиро-ванности внутреннего С Нра II, напротив, узнает ту же последовательность лишь в том случае, если внутренний С не метилирован. [c.269]

Таблица ИЛ. Известные сайты узнавания для рестриктаз в последовательности плазмиды рОУ230, несущей встроенную овальбуминовую кДНК (остатки 13-1872 на рис. 11.18)

Справочник химика 21

Химия и химическая технология