Ретровирусные векторы

Использование ретровирусных векторов Преимущество метода, основанного на использовании ретровирусных векторов (рис. 19.1), перед другими методами трансгеноза состоит в его эффективности. Однако размер вставки в этом случае ограничивается 8 т. п. н., вследствие чего трансген может оказаться лишенным прилегающих регуляторных последовательностей, необходимых для его экспрессии. [c.419]

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность. [c.419]

Генетическая модификация животных при помощи технологии рекомбинантных ДНК (трансгеноза) основана на введении клонированного гена(ов) в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии. Скрещивая трансгенных потомков, появившихся в результате такой операции, можно получить гомозиготные линии трансгенных животных. Большинство исследований в этой области проводилось на мышах. Обычно для этого вводили клонированный ген в оплодотворенную яйцеклетку мыши с помощью микроинъекции, имплантировали ее в реципиентную самку и проверяли потомство на наличие введенного гена. Чужеродный ген можно вводить в оплодотворенную яйцеклетку мыши и с помощью ретровирусного вектора. Альтернативный подход заключается в выделении мышиных эмбриональных [c.439]

ДНК ретровирусного вектора можно использовать для трансформации клеток саму по себе, но эффективность доставки ее в ядро и интеграции в геном клетки-хозяина крайне низка. Поэ- [c.488]

Рис. 21.3. Генетическая карта ретровирусного вектора, несущего два гена. Транскрипция терапевтического гена (Ген X) контролируется 5 -LTR-промотором, транскрипция селективного маркерного гена (Neo ) — внутренним промотором (р). 3 -LTR содержит сигнал полиаденилирования. - последовательность, ответственная за упаковку.

В ретровирусную векторную систему внесены дополнительные усовершенствования увеличено число образующихся вирусных частиц, повышена эффективность трансдукции, осуществлена генноинженерная модификация, обеспечивающая их проникновение в неделящиеся клетки, повышена специфичность инфекции. В последнем случае геном рекомбинантного ретровирусного вектора упаковывается в оболочку другого вируса, белок которой и определяет специфичность связывания ретровируса и спектр [c.493]

Ретровирусный вектор может включить лишь около 10000 пн. Имея в руках готовый вирусный вектор, им можно инфицировать подходящие клетки-мишени, например, фибробласты, экспрессирующие соответствующие поверхностные рецепторы. [c.585]

В 1990 г. в США двое детей в возрасте 4 и 9 лет были выбраны для генной терапии. В выделенные лимфоциты детей с помощью ретровирусного вектора был встроен нормальный ген аденозиндезаминазы и после этого лимфоциты вернули на место. Лечение нужно было повторять каждые 1—2 месяца. Через год было отмечено заметное улучшение дети проявляли иммунный ответ и начали ходить в школу. [c.265]

Ретровирусные векторы, описанные в предпоследней главе, находят сейчас все более широкое применение в практике моле-кулярно-биологических исследований. Мы постарались не погружаться в узкоспециальные проблемы, связанные с ретровирусными векторами, а рассмотреть принципиальные вопросы, касающиеся конструирования и использования подобных систем. [c.9]

Применение ретровирусных векторов [c.273]

Поскольку ретровирусная инфекция обычно приводит к интеграции единственной копии вирусного генома в ДНК клетки-хозяина, ретровирусные векторы, несущие чужеродные гены, могут выполнять роль уникальных генетических маркеров индивидуальных хромосом в экспериментах по гибридизации соматических клеток, хромосомному переносу генов, а также в исследованиях рекомбинационных процессов [9]. [c.273]

Следующий раздел касается некоторых фундаментальных аспектов биологии ретровирусов, на которых базируется их применение в качестве векторных молекул. Разд. 9.3 дает представление о различных конструкциях ретровирусных векторов. В разд. 9.4—9.6 описаны методы размножения вирусов, инфицирования клеток и тестирования вирусных препаратов. Заключительный, разд. 9.7 касается некоторых практических вопросов, которые следует принимать во внимание при работе с данными векторами. [c.274]

Дополнительные внутренние промоторы вводили в ретровирусные векторы в обеих ориентациях относительно направления транскрипции с вирусного LTR. В тех случаях, когда внутренний промотор имел встречную ориентацию, продуцирование вируса несколько ухудшалось, что, по-видимому, было обусловлено неблагоприятным транскрипционным взаимодействием противо- [c.282]

Рис. 19.1. Получение линии трансгенных мышей с использованием ретровирусных векторов. Эмбрион, обычно находящийся на стадии 8 клеток, инфицируют рекомбинантным ретровирусом, несущим трансген. Самки, которым бьи имплантирован эмбрион ( суррогатные матери), производят на свет трансгенное потомство. Для идентификации мьщ1ат, несущих трансген в клетках зародьшгевой лршии, проводят ряд скрещиваний.

Для получения ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретровируса встраивают в плазмиду, с помощью эндонуклеазного расщепления удаляют большую часть гена gag и гены pol и env, оставляя 5 "-концевой участок гена gag и 5 - и 3"-LTR, а затем рядом с / -областью встраивают терапевтический ген, транскрипция которого будет контролироваться 5"-LTR-промотором при необходимости можно встроить и маркерный селективный ген с собственным промотором (рис. 21.3). Такая конструкция позволяет экспрессировать оба клонированных гена, На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы. Максимальный размер ДНК-вставки, которую может переносить ретровирусный вектор, - примерно 8 т. п. н. [c.488]

В пакующей клеточной линии не образуются компетентные по репликации ретровирусы дикого типа, способные встраиваться в гены и приводить к некотролируемой пролиферации некоторых клеток (т. е. к превращению их в раковые клетки). Это весьма существенно, особенно если частицы ретровирусного вектора предполагается использовать для геной терапии соматических клеток человека. В качестве меры предосторожности все же проводят регулярное тестирование готовых ретровирусных векторов, с тем чтобы выявить ретровирусы дикого типа. Кроме того, в пакующей клеточной линии нуклеотидные последовательности ретровируса и вектора локализованы в трех разных областях хромосомы, что делает весьма маловероятной возможность последовательных рекомбинационных событий, которые могли бы привести к образованию компетентного по репликации ретровируса. [c.489]

Рис. 21.4. Получение упакованного ретровирусного вектора. В двух разных участках хромосом пакующей клеточной линии содержатся ретровирусные гены в одном - gag, в другом — pol и env. Их транскрипция контролируется 5 -LTR-np0M0T0p0M оба участка лищены последовательности, необходимой для упаковки Па-

К сожалению, тотинотентные стволовые клетки очень трудно выделять из костного мозга и культивировать. Исследования по ех vivo-ген-ной терапии S ID, вызванного дефицитом АДА, проводили на аутологичных Т-клетках, модифицированных с помощью ретровирусных векторов. Т-лимфоциты имеют ограниченное время жизни, поэтому необходимо проводить их повторные инфузии. В первом испытании двум девочкам вливали с интервалом в несколько месяцев собственные генетически исправленные Т-клетки, продуцирующие АДА. Наблюдаемый положительный эффект, возможно, объяснялся снижением уровня аденозина и дезоксиаденозина в крови и предотвращением гибели В- и Т-клеток. [c.491]

Генная терапия in vivo предполагает доставку терапевтического гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента (рис. 21.6). Ретровирусные векторы проникают только в делящиеся клетки-мишени, однако во многих тка- [c.493]

При генной терапии ех vivo терапевтический ген переносят в изолированные клетки больного с помошью ретровирусных векторов или других систем доставки, трансдуцированные клетки культивируют и вводят пациенту. При этом у реципиента не развивается нежелательного иммунного ответа, но сама процедура является весьма дорогостоящей и трудоемкой. Альтернативный способ генной терапии ех vivo использует генноинженерную модификацию неаутологичных клеток, заключенных в мембрану, которая предотвращает развитие нежелательного ответа и не препятствует высвобождению терапевтического генного продукта. [c.510]

Как уже было сказано в начале этого раздела, другим методом получения трансгенных животных (в частности, мышей) является заражение предимплантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами, которые оказались удобными объектами для этих целей. Геном ретровирусов сравнительно небольшой и с ним относительно легко манипулировать, вводя в него чужеродные гены ретровирусы достаточно инфекционны в отношении пермис-сивных клеток (почти 100% заражение их), а единственна копия ретровирусного генома ДНК прочно и строго определённым образом интегрируется с ДНК клетки-мишени и эти последние способны экспрессировать привнесенные вирусом гены. Уровень экспрессии клонированных генов заметно повышается вследствие того, что в ретровирусах имеются весьма активные транскрипционные энхасеры, или усилители (см.). Известные ретровирусные векторы ведут свое происхождение от вирусов лейкоза мышей (MLV) или от вирусов птиц (ALV). [c.584]

Ретровирусные векторы.В опытах han A.W.S. et al. (1998) трансгенные телята были получены путем введения гена с ретровирусным вектором непосредственно в ооцит. Несмотря на то что эта система ограничена размером трансгенов в связи с ограничениями ретровирусного вектора, она представляет альтернативный метод, по крайней мере, для тех видов, у которых возможно оплодотворение in vitro. [c.230]

Хотя применение ретровирусных векторов требует, чтобы экспрессируемый ген был введен в соответствующий вектор в строго определенной ориентации (это условие в общем случае ограничивает их использование лишь для хорошо охарактеризованных последоательностей) после того, как правильная рекомбинантная конструкция получена, дальнейшие операции по наращиванию вируса и инфицированию клеток-мишеней технически оказываются достаточно простыми. [c.272]

Ретровирусные векторы наряду с тем, что они являются, эффективным инструментом для осуществления экспрессии генов в культивируемых клетках, могут быть использованы для прямого инфицирования клеток in vivo, например путем внутри-брюшинной инъекции новорожденным мышам [1]. [c.273]

С помощью ретровирусной инфекции гемопоэтическпх стволовых клеток в культурах костного мозга и их последующей трансплантации облученным мышам можно заменить всю гемопоэтическую ткань животного клетками, содержащими ретровирусный вектор [2]. Можно надеяться, что эксперименты такого рода приблизят возможность лечения ряда наследственных дефектов методами генотерапии [3]. [c.273]

Инфицирование плюрипотентных стволовых клеток ретровирусными векторами дает возможность получать легко идентифицируемые маркеры для исследования рядов клеточных поколений, формирующихся, например, в процессе дифферен-цировки тканей [6, 7] или в ходе эмбрионального развития [8]. [c.273]

Ретровирусные векторы можно использовать в качестве инсерционных (включающихся в хромосому) мутагенов как для культивируемых клеток, так и для трансгенных животных. Введение в состав вектора маркерного гена, который бы обеспечивал возможность селекции в Е. соИ, может зна -гятельно облегчить дальнейшие манипуляции с последовательностями мутантного локуса [10]. [c.273]

Поскольку геномная РНК ретровирусов претерпеэает сплайсинг, интронные последовательности, введенные в сойтав ретровирусного вектора, могут точно выщепляться из вирусного генома. Следовательно, путем клонирования провирусной ДНК после инфицирования с помощью ретровирусных векторов можно получать полноразмерные кДНК-копии генов среднего размера [И, 12]. [c.274]

Цель настоящей главы — очертить рамки практического использования ретровирусов в качестве экспрессирующих векторов общего назначения и описать методы размножения вирусов, тестирования и инфицирования, которые являются общими для большинства процедур, описанных выше. Всех деталей специализированных экспериментов мы касаться не будем. Большинство ретровирусных векторов, описанных на сегодняшний день, ведет свое происхожедние либо от вирусов птиц, либо от вирусов лейкоза мышей (ВЛМ, МЬУ). В данной главе мы сконцентрируем внимание на векторных системах типа МЬУ и экспериментальных процедурах, связанных с использованием этих векторов. [c.274]

Мы рассмотрим лишь некоторые аспекты жизненного цикла ретровирусов, представляющие интерес в данном контексте — а именно те, которые имеют отношение к специфичности круга хозяев ретровирусных векторов. Круг хозяев ретровируса дикого Tina можно ограничить как на внеклеточг10Й, так и на внутриклеточной стадии его жизненного цикла [151. При этом особого внимания заслуживает внеклеточная стадия, включающая взаимодействие белков вирусной оболочки с поверхностными клеточными рецепторами. [c.277]

В случае простейшего ретровирусного вектора транс-дейст-вующие вирусные структурные гены удаляют и на их место встраивают один или несколько рестрикционных сайтов для клонирования. Известно несколько векторов этого типа (см., например, [18, 19]). В качестве примера вектора, рассчитанного на клонирование одиночных генов, можно назвать вектор на основе вируса лейкоза мышей Молони (Mo-MLV), обозначаемый рМХ1112 (рис. 9.3, а). В этой конструкции полилинкер содержащий множественные рестрикционные сайты для клонирования, введен на место удаленных вирусных генов gag, pol и env. Клонированный в данном векторе чужеродный ген эффективно экспрессируется благодаря промотору в составе вирусного 5 -LTR, а наличие ч с-действующих вирусных последовательностей позволяет этой системе формировать инфекционные части- [c.279]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология