Ретровирусные гены env

Рис. 21.3. Генетическая карта ретровирусного вектора, несущего два гена. Транскрипция терапевтического гена (Ген X) контролируется 5 -LTR-промотором, транскрипция селективного маркерного гена (Neo ) — внутренним промотором (р). 3 -LTR содержит сигнал полиаденилирования. - последовательность, ответственная за упаковку.

Генетическая модификация животных при помощи технологии рекомбинантных ДНК (трансгеноза) основана на введении клонированного гена(ов) в геном клетки, которая могла бы дать начало клеткам зародышевой линии. Скрещивая трансгенных потомков, появившихся в результате такой операции, можно получить гомозиготные линии трансгенных животных. Большинство исследований в этой области проводилось на мышах. Обычно для этого вводили клонированный ген в оплодотворенную яйцеклетку мыши с помощью микроинъекции, имплантировали ее в реципиентную самку и проверяли потомство на наличие введенного гена. Чужеродный ген можно вводить в оплодотворенную яйцеклетку мыши и с помощью ретровирусного вектора. Альтернативный подход заключается в выделении мышиных эмбриональных [c.439]

Манн и др. сконструировали первую клеточную линию для упаковки ретровирусов. Для этого они встроили вирусный геном с предварительно удаленной нуклеотидной последовательностью, ответственной за упаковку, в хромосому клеточной линии, которая в этих условиях производит неинфекционные вирусные частицы. После трансфекции этих клеток ДНК-конструкцией, которая содержала последовательность, необходимую для упаковки, и терапевтический ген, но не содержала ретровирусные гены. [c.492]

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность. [c.419]

ДНК ретровирусного вектора можно использовать для трансформации клеток саму по себе, но эффективность доставки ее в ядро и интеграции в геном клетки-хозяина крайне низка. Поэ- [c.488]

В ретровирусную векторную систему внесены дополнительные усовершенствования увеличено число образующихся вирусных частиц, повышена эффективность трансдукции, осуществлена генноинженерная модификация, обеспечивающая их проникновение в неделящиеся клетки, повышена специфичность инфекции. В последнем случае геном рекомбинантного ретровирусного вектора упаковывается в оболочку другого вируса, белок которой и определяет специфичность связывания ретровируса и спектр [c.493]

Существует ряд векторов на основе ретровирусного генома. В простейших случаях удаляют структурные гены и на их место встраивают один или больше рестрикционных сайтов в целях [c.584]

В 1990 г. в США двое детей в возрасте 4 и 9 лет были выбраны для генной терапии. В выделенные лимфоциты детей с помощью ретровирусного вектора был встроен нормальный ген аденозиндезаминазы и после этого лимфоциты вернули на место. Лечение нужно было повторять каждые 1—2 месяца. Через год было отмечено заметное улучшение дети проявляли иммунный ответ и начали ходить в школу. [c.265]

Поскольку ретровирусная инфекция обычно приводит к интеграции единственной копии вирусного генома в ДНК клетки-хозяина, ретровирусные векторы, несущие чужеродные гены, могут выполнять роль уникальных генетических маркеров индивидуальных хромосом в экспериментах по гибридизации соматических клеток, хромосомному переносу генов, а также в исследованиях рекомбинационных процессов [9]. [c.273]

Рис. 21.4. Получение упакованного ретровирусного вектора. В двух разных участках хромосом пакующей клеточной линии содержатся ретровирусные гены в одном - gag, в другом — pol и env. Их транскрипция контролируется 5 -LTR-np0M0T0p0M оба участка лищены последовательности, необходимой для упаковки Па-

Плазмовирус (Plasmovirus) Генетическая конструкция, которая содержит ретровирусные гены, находящиеся под контролем 5-LTR-npoMOTopa, а также терапевтический ген и ген env, управляемые цитомегаловирусным промотором. [c.556]

Продукт ORF В Ту-элемента отчасти гомоло-1ичен полипептидам, кодируемым ретровирусными генами pol (табл. 10.4). У ретровирусов эти гены кодируют несколько ферментов, в том числе про-теазу, эндонуклеазу, называемую также интегразой, и обратную транскриптазу (RT). Если в дрожжевых клетках Ту-элемент эффективно транскрибируется и транслируется, то в клеточных экстрактах обнаруживается активная обратная транскриптаза, а в частично очищенных фракциях таких экстрактов при добавлении дезоксинуклеозидтрифосфатов и синтезируется Ту-ДНК. Внесение мутации в ORF В приводит к утрате ферментативной активности, показывая еще раз, что обратная транскриптаза кодируется Ту-элементом. Клетки, в которых [c.252]

A. Типичный ретровирусный геном дикого типа с генами белков нуклеокапсида (.дад), обратной транскриптазы (роГ) и белка оболочки (env). Б. Недефектный ретровирусный геном, несущий ген м-опс (sr ). В. Дефектный ретровирусный геном, несущий онкоген аЫ и неспособный реплицироваться независимо, поскольку отсутствуют гены ро и env. Г. Ретровирус иммуно- [c.349]

Отбор клеток, трансформированных ретровирусными векторами. А. Рекомбинантный геном содержит ген gpt Е.соИ. После проникновения вириона в клетку происходит образование дуплексной ДНК, катализируемое обратной транскриптазой, присутствующей в рекомбинантном вирионе. Эта ДНК встраивается в клеточный геном, образуя провирус. Трансформированные клетки можно отобрать благодаря экспрессии гена gpt, снимающей ингибирующий эффект микофеноловой кислоты. Если в рекомбинантную молекулу включен какой-то неселективный ген, он тоже экспрессируется. Б. Ретровирусный геном содержит онкоген. Трансформированные клетки можно идентифицировать по их способности образовывать фокусы, тогда как нетрансформированные клетки образуют лищь монослой. В этом случае в трансформированных клетках также экспрессируется неселективный ген, включенный в трансформирующий геном. [c.271]

Клетки, выделенные из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, могут пролиферировать в культуре, сохраняя способность к дифференци-ровке в любые типы клеток, в том числе и в клетки зародышевой линии, при введении в другой эмбрион на стадии бластоцисты. Такие клетки называются плюрипотентными эмбриональными стволовыми клетками (Е5). Е8-клет-ки в культуре легко модифицировать методами генной инженерии без нарушения их плюрипо-тентности. Например, в определенный сайт несущественного гена в их геноме можно встроить функциональный трансген. Затем можно отобрать измененные клетки, культивировать их и использовать для получения трансгенных животных (рис. 19.4). Это позволяет избежать случайного встраивания, характерного для метода микроинъекций и ретровирусных векторных систем. [c.422]

Для получения ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретровируса встраивают в плазмиду, с помощью эндонуклеазного расщепления удаляют большую часть гена gag и гены pol и env, оставляя 5 "-концевой участок гена gag и 5 - и 3"-LTR, а затем рядом с / -областью встраивают терапевтический ген, транскрипция которого будет контролироваться 5"-LTR-промотором при необходимости можно встроить и маркерный селективный ген с собственным промотором (рис. 21.3). Такая конструкция позволяет экспрессировать оба клонированных гена, На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы. Максимальный размер ДНК-вставки, которую может переносить ретровирусный вектор, - примерно 8 т. п. н. [c.488]

В пакующей клеточной линии не образуются компетентные по репликации ретровирусы дикого типа, способные встраиваться в гены и приводить к некотролируемой пролиферации некоторых клеток (т. е. к превращению их в раковые клетки). Это весьма существенно, особенно если частицы ретровирусного вектора предполагается использовать для геной терапии соматических клеток человека. В качестве меры предосторожности все же проводят регулярное тестирование готовых ретровирусных векторов, с тем чтобы выявить ретровирусы дикого типа. Кроме того, в пакующей клеточной линии нуклеотидные последовательности ретровируса и вектора локализованы в трех разных областях хромосомы, что делает весьма маловероятной возможность последовательных рекомбинационных событий, которые могли бы привести к образованию компетентного по репликации ретровируса. [c.489]

Каждая вирусная частица содержит две копии одноцепочечного РНК-генома, а после проникновения в пермиссивную клетку этот геном переводится в линейную двухнитевую ДНК под влиянием вирусного фермента — обратной транскриптазы. Чтобы интегрироваться в клеточный геном клетки-мишени, линейная ДНК проникает в ядро, где приобретает кольцевидную форму. Интегрированная линейная ДНК-копия ретровирусного генома (провирус) имеет на обоих концах длинные нуклеотидные повторы — LTR (от англ. long termine repeats). 5 LTR несет промотор, с которого начинается транскрипция генов интегрированного провируса 3 LTR-сайт полиаденилирования, где происходит терминация РНК-транскриптов (см. рис. 23). [c.584]

К сожалению, тотинотентные стволовые клетки очень трудно выделять из костного мозга и культивировать. Исследования по ех vivo-ген-ной терапии S ID, вызванного дефицитом АДА, проводили на аутологичных Т-клетках, модифицированных с помощью ретровирусных векторов. Т-лимфоциты имеют ограниченное время жизни, поэтому необходимо проводить их повторные инфузии. В первом испытании двум девочкам вливали с интервалом в несколько месяцев собственные генетически исправленные Т-клетки, продуцирующие АДА. Наблюдаемый положительный эффект, возможно, объяснялся снижением уровня аденозина и дезоксиаденозина в крови и предотвращением гибели В- и Т-клеток. [c.491]

Генная терапия in vivo предполагает доставку терапевтического гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента (рис. 21.6). Ретровирусные векторы проникают только в делящиеся клетки-мишени, однако во многих тка- [c.493]

При генной терапии ех vivo терапевтический ген переносят в изолированные клетки больного с помошью ретровирусных векторов или других систем доставки, трансдуцированные клетки культивируют и вводят пациенту. При этом у реципиента не развивается нежелательного иммунного ответа, но сама процедура является весьма дорогостоящей и трудоемкой. Альтернативный способ генной терапии ех vivo использует генноинженерную модификацию неаутологичных клеток, заключенных в мембрану, которая предотвращает развитие нежелательного ответа и не препятствует высвобождению терапевтического генного продукта. [c.510]

Как уже было сказано в начале этого раздела, другим методом получения трансгенных животных (в частности, мышей) является заражение предимплантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами, которые оказались удобными объектами для этих целей. Геном ретровирусов сравнительно небольшой и с ним относительно легко манипулировать, вводя в него чужеродные гены ретровирусы достаточно инфекционны в отношении пермис-сивных клеток (почти 100% заражение их), а единственна копия ретровирусного генома ДНК прочно и строго определённым образом интегрируется с ДНК клетки-мишени и эти последние способны экспрессировать привнесенные вирусом гены. Уровень экспрессии клонированных генов заметно повышается вследствие того, что в ретровирусах имеются весьма активные транскрипционные энхасеры, или усилители (см.). Известные ретровирусные векторы ведут свое происхождение от вирусов лейкоза мышей (MLV) или от вирусов птиц (ALV). [c.584]

Ретровирусные векторы.В опытах han A.W.S. et al. (1998) трансгенные телята были получены путем введения гена с ретровирусным вектором непосредственно в ооцит. Несмотря на то что эта система ограничена размером трансгенов в связи с ограничениями ретровирусного вектора, она представляет альтернативный метод, по крайней мере, для тех видов, у которых возможно оплодотворение in vitro. [c.230]

В геноме ряда вирусов имеются элементы, несущие ту же функцию, что и 72-нуклеотидная последовательность вируса 8У40, хотя они не гомологичны друг другу. В пользу предположения о том, что эти элементы могут выполнять сходные функции, свидетельствует тот факт, что аналогичные компоненты генома ретровирусов могут заменять энхансеры в ДНК вируса 8У40. Возможно, что эта часть ретровирусной ДНК вовлечена в активацию клеточных генов. [c.154]

Использование ретровирусов в качестве векторных молекул за последние годы обрело статус наиболее перспективного и универсального метода введения и экспрессии клонированных генов в эукариотических клетках. Многие свойства ретровирусов делают их более удобными для таких исследований, чем методы прямого генетического переноса или использование потенциальных вирусных векторных систем. Во-первых, относительно небольшой геном ретровирусов позволяет довольно просто с ним манипулировать и вводить в его состав чужеродные гены таким образом, чтобы любой возникаюш,ий при этом дефект вирусной репликации мог бы комплементироваться по транс-схеме. Во-вторых, вирусы можно легко нарастить в культуре до высокого титра. Эффективность инфицирования пермиссивных клеток чрезвычайно высока, что в сочетании с высоким титром вирусных препаратов позволяет получать в культуре почти 100%-ное заражение клеток-мишеней. После инфицирования единственная копия ретровирусной ДНК оказывается стабильно интегрированной в геном клетки-хозяина строго определенным образом, так что практически все инфицированные клетки способны экспрессировать гены, привнесенные вирусом. Кроме того, ретровирусы содержат мощные транскрипционные знхансеры, которые существенно повышают уровень экспрессии клонированных генов в клетках различных типов. [c.272]

Хотя применение ретровирусных векторов требует, чтобы экспрессируемый ген был введен в соответствующий вектор в строго определенной ориентации (это условие в общем случае ограничивает их использование лишь для хорошо охарактеризованных последоательностей) после того, как правильная рекомбинантная конструкция получена, дальнейшие операции по наращиванию вируса и инфицированию клеток-мишеней технически оказываются достаточно простыми. [c.272]

Ретровирусные векторы наряду с тем, что они являются, эффективным инструментом для осуществления экспрессии генов в культивируемых клетках, могут быть использованы для прямого инфицирования клеток in vivo, например путем внутри-брюшинной инъекции новорожденным мышам [1]. [c.273]

Ретровирусные векторы можно использовать в качестве инсерционных (включающихся в хромосому) мутагенов как для культивируемых клеток, так и для трансгенных животных. Введение в состав вектора маркерного гена, который бы обеспечивал возможность селекции в Е. соИ, может зна -гятельно облегчить дальнейшие манипуляции с последовательностями мутантного локуса [10]. [c.273]

Поскольку геномная РНК ретровирусов претерпеэает сплайсинг, интронные последовательности, введенные в сойтав ретровирусного вектора, могут точно выщепляться из вирусного генома. Следовательно, путем клонирования провирусной ДНК после инфицирования с помощью ретровирусных векторов можно получать полноразмерные кДНК-копии генов среднего размера [И, 12]. [c.274]

Поскольку все описанные на сегодняшний день упаковывающие MLV-клетки ведут свое начало либо от линий NIH3T3 либо от линии BALB/ ЗТЗ, рекомбинантную ретровирусную ДНК в них можно легко ввести путем трансфекции, используя стандартный метод кальций-фосфатной преципитации 34]. Непродолжительная, так называемая временная (transient), трансфекция может оказаться достаточной, чтобы получить вирусный препарат с низким титром (обычно 10—Ю /мл). Однако для достижения более высоких концентраций вируса необходимы стабильно трансформированные клеточные линии, экспрессирующие доминантный селективный маркер. Такие линии позволяют получать препараты вируса с титром Ю —10 инфекционных ед./мл. Титр вирусных препаратов, полученных путем временной трансфекции, можно повысить, если использовать гибридный ретровирусный вектор, содержащий полную область ранних генов вируса полиомы такая конструкция претерпевает в упаковывающих клетках мультикопийную внехромосомную репликацию [35]. [c.288]

В случае простейшего ретровирусного вектора транс-дейст-вующие вирусные структурные гены удаляют и на их место встраивают один или несколько рестрикционных сайтов для клонирования. Известно несколько векторов этого типа (см., например, [18, 19]). В качестве примера вектора, рассчитанного на клонирование одиночных генов, можно назвать вектор на основе вируса лейкоза мышей Молони (Mo-MLV), обозначаемый рМХ1112 (рис. 9.3, а). В этой конструкции полилинкер содержащий множественные рестрикционные сайты для клонирования, введен на место удаленных вирусных генов gag, pol и env. Клонированный в данном векторе чужеродный ген эффективно экспрессируется благодаря промотору в составе вирусного 5 -LTR, а наличие ч с-действующих вирусных последовательностей позволяет этой системе формировать инфекционные части- [c.279]

В тех случаях, когда определяющим фактором исследования является оптимальная экспрессия продукта интересующего гена, а возможные ограничения в субклеточной локализации приемлемы или даже желаемы, целесообразно использовать ретровирусный вектор, приспособленный для состыковки генов. Например, вектор рМХ262 (рис. 9.3, г). Он несет множестпснные сайты для клонирования за ЛоЬсайтом гена gag Mo-MLV и позволяет получать рекомбинантные конструкции гена gag, экспрессирующие гибридные белки. [c.284]

Пока еще не создано репликационно-компетентного мышин-ного ретровирусного вектора общего назначения. Объясняется это как отсутствием подходящих сайтов для введения чужеродных генов в MLV (которые бы не нарушали целостность функционально важных вирусных последовательностей), так и ограничениями, накладываемыми на размер вирусного генома [4]. Тем не менее одной из удачных попыток можно считать введение коротких последовательностей в состав вирусных LTR. Таким путем была получена репликационно-компетентная рекомбинантная конструкция на основе MLV, несущая ген супрессорной тРНК Е. соли (SupF) [30], которая оказалась неплохим [c.285]

Учитывая возможные осложнния, связанные со сплайсингом, кДНК-вставки (если они доступны) предпочтительны по сравнению с последовательностями, содержащими интроны. Хотя ретровирусные векторы обладают способностью точно удалять интроны из геномных последовательностей и таким образом генерировать кДНК-копии клонированных генов, этот процеса не всегда достаточно эффективен [14]. [c.287]

Для получения стабильно трансформированных клеточных линий также используется стандартная процедура кальций-фосфатной трансфекции и затем селекция на доминантный маркер, который либо введен в состав самого ретровирусного вектора, либо находится в составе отдельной вспомогательной плазмиды, участвующей в котрансфекции. В качестве маркера обычно используют бактериальный ген neo, обеспечивающий устойчивость клеток млекопитающих к аналогу неомицина G418. Процедура трансфекции с последующей селекцией на устойчивость к G418 описана в табл. 9.2. [c.289]

Альтернативой введению ретровирусной векторной ДНК в упаковывающие клетки для получения вирусных препаратов, свободных от хелперных компонентов, служит использование любых других клеток, несущих рекомбинантную провирусную ДНК, в которые вводится путем трансфекции хелперный геном MLV с делетированным собственным упаковывающим сигналом. Эта процедура с высокой эффективностью превращает исходные клетки в упаковывающие. Метод особенно удобен в тех случаях, когда требуется получить рекомбинантный впрус из клеток, в которых уже содержится провирусная ДНК. [c.291]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология