Десорбция аффинного лиганда

ДЕСОРБЦИЯ ПРИСОЕДИНЕННОГО АФФИННОГО ЛИГАНДА [c.219]

Математический подход к десорбции лиганда в аффинной хроматографии [25] [c.221]

Особый вид аффинной хроматографии включает использование гидрофобных взаимодействий между доступными гидрофобными центрами белка и гидрофобными лигандами на носителе [31—34]. В этом случае десорбция происходит при уменьшении ионной силы и увеличении pH или при элюировании растворами этиленгликоля и детергентов. [c.110]

Другим примером влияния концентрации аффинного лиганда является аффинная хроматография смеси лактатдегидрогеназы и сывороточного альбумина на N -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе [8]. При высоких концентрациях лиганда (1,5 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) для элюирования с )ермента необходимо введение NADH ( удар ). При низких концентрациях (0,125 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) десорбция фермента достигается просто градиентом концентрации (от О до 1 моль/л) хлорида калия. Дальнейшее уменьшение количества прикрепленного лиганда (0,025 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) приводит к прогрессивному увеличению доли лактатдегидрогеназы, элюируемой исходным уравновешивающим буфером даже перед наложением линейного градиента солей. В то же время [c.75]

Из вышеизложенного следует, что кроме природы нерастворимого носителя существенную роль играет также метод связывания. В табл. 8.12 дан обзор методов связывания, рассмотренных в разд. 8.2 и 8.3. При выборе методов связывания главное внимание уделяется тому, какие группы аффинного лиганда можно использовать для присоединения к нерастворимой матрице без затрагивания связывающих участков аффинных лигандов. Если доступно несколько групп, рекомендуется выбрать наиболее избирательный метод, потому что желательна специфическая связь через одну определенную функциональную группу. Присоединение не должно приводить к появлению в специфическом сорбенте неспецифически сорбирующих групп. Поэтому лучше привязывать к аффинному лиганду пространственную группу и только модифицированный таким образом лиганд присоединять к нераствори-мовду носителю. В результате образования связи между поверхностью нерастворимого носителя и аффинным лигандом не должно возникать ни в носителе, ни в аффинном лиганде неспецифически сорбирующих групп эта связь должна быть устойчивой в ходе сорбции, десорбции и регенерации (см. разд. 8.5). При выборе метода необходимо принимать во внимание также зависимость устойчивости аффинного лиганда от pH. Кислые протеина-зы, например, нельзя связывать в щелочных средах, поскольку они будут при этом инактивироваться. Поэтому в табл. 8.12 приводится также значение pH, при котором проводится связывание. Однако во многих методах могут быть получены хорошие результаты даже при низких pH (связывание в нейтральной среде на [c.229]

Специфический комплекс выделяемых веществ с иммобилизованным аффинным лигандом может распадаться в результате пространственного модифицирования, напрпмер, мочевиной, солями гуанидина или хаотропными ионами. Эти реагенты разрушают водородные связи или изменяют структуру воды вблизи гидрофобных областей. При использовапии этих реагентов следует помнить, что компоненты комплекса могут быть необратимо разрушены при выделении. Однако известно, главным образом для иммобилизованных ферментов, что присоединение белков к нерастворимым носителям приводит к повышению стабильности. Подбирая концентрацию, температуру и время обработки, можно конформационные изменения адсорбционных участков ири десорбции уменьшить до минимальных то же самое относится и к обратимым конформаци-онным изменениям молекул в целом как выделяемых веществ, так и иммобилизованных аффинных лигандов. На практике следует предварительно найти минимальную концентрацию, необходимую [c.270]

Теперь можно вернуться к процедуре посадки лиганда на матрицу. После окончания инкубации необходимо блокировать не использованные в реакции с лигандом активные группы матрицы. Для этого сорбент переносят в 1 М раствор этанола.мина или 0,2 М раствор глицина при pH 8 и снова перемешивают, как при посадке лиганда. Наконец, для удаления избытков лиганда и блокирующих агентов гель промывают на воронке 4—5 раз попеременно кислым и щелочным буферами, например 0,1 М Na-ацетатным (pH 4) и буфером. используемым для посадки лиганда, добавляя в оба буфера до 0,5 М Na l. Чередование pH при промывке способствует десорбции неспецифическп сорбированного на матрице материала. Промытый аффинный сорбент переводят в буфер для хроматографии и хранят на холоду. [c.377]

Вообще тщательную промывку аффинного сорбента перед его использованием, а особенно после длительного хранения следует предусмотреть в любом варианте аффинной хроматографии. Дело в том, что при хранении идет медленный гидролиз связей лигандов с матрицей, приводящий к освобождению, или подтеканию , лигандов ( leakage , bleeding ). Это явление опасно не уменьшением емкости сорбента (на доли процента), а тем, что перешедшие в раствор молекулы лиганда могут оказаться на два-три порядка более активными в отношении связывания вещества, чем иммобилизованные молекулы. Это создает ситуацию конкурентной элюции в тот момент, когда должна происходить посадка вещества на сорбент. Результатом такой ситуации может оказаться заметное уменьшение и даже полное отсутствие задержания вещества на сорбенте. Подтекание лигандов может происходить не только за счет отрыва их ковалентно связанных молекул от матрицы, но и в результате постепенной десорбции тех молекул лиганда, которые не были отмыты после посадки его на матрицу. [c.410]

Оптимальными /шгандами для аффинной хроматографии ферментов являются соответствующие субстраты, однако в общем случае их применению мешает быстрое превращение в продукты ферментативной реакции и как следствие снижение эффективности и деструкция сорбентов. Тем не менее субстраты могут быть использованы в качестве лигандов, если при определенных условиях скорость каталической реакции понижена, а связывание с ферментом остается достаточно сильным. Такие условия могут быть созданы путем понижения температуры (от —2 до —50 °С), когда прочность фермент-субстратного комплекса достаточна для удерживания фермента на колонке, в то время как его десорбция легко достигается при повышении температу-ры [5]. [c.189]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология