Флуоресцентная метка в ферментах

Флуоресцентные зонды и метки являются удобным инструментом для исследования биологических мембран и мембранных ферментов. Испо 1ьзование зондов разной природы, способных связываться с белками или встраиваться в различные области липидного бислоя, а также меток, ковалентно реагирующих с функциональными группами белков или липидов, позволяет получить ценную информацию о состоянии и подвижности белка в мембране, состоянии липидного матрикса, характере белок-белковых и белок-липидных взаимодействий. [c.365]

Рмс. 7.9-16. Флуоресцентный иммунный анализ с субстратом-меткой. Антитело, связанное с меченым гаптеном, ингибирует его как субстрат для фермента. [c.598]

Степень структурной организованности цитозоля в настоящее время является предметом споров. Источник наших знаний об идущих в цитозоле процессах - это в основном биохимические исследования, а они начинаются с гомогенизации клетки, так как только после этого можно определять активность ферментов и выделять их в очищенном виде. Успехи такого подхода привели многих биохимиков к представлению о цитозоле как о простом растворе ферментов. Однако другие исследователи склонны полагать, что едва ли не большинство ферментов цитозоля собрано в группы по принадлежности к тому или иному биохимическому пути и прикреплено к цитоскелету так, чтобы обеспечить более быстрое и эффективное прохождение метаболитов но каждому из таких путей. Поскольку это прикрепление, вероятно, непрочно и связи легко разрушаются, для его убедительной демонстрации могут потребоваться новые методы - такие, например, как инъекции в живые клетки белков с флуоресцентными метками (разд. 4.2.3). [c.322]

Хотя в последние годы опубликовано немало статей, описывающих преимущества ФИА, соответствующие наборы и приборы стали выпускать в промышленном масштабе только недавно. Флуоресцентные метки значительно дешевле изотопных, срок годности наборов ФИА намного больше, чем наборов РИА, а флуоресценцию можно измерять на простых флуориметрах. Многие достоинства ФИА свойственны и методам ИФА (доступность методик ковалентного связывания ферментов с антигенами или антителами, стабильность меченых продуктов, безопасность и др.). Главный недостаток ИФА связан со способом измерения результата анализа, а именно с необходимостью дополнительной операции определения активности фермента с помощью соответствующего субстрата. Эта операция усложняет и замедляет анализ и в принципе может сни- [c.139]

С., меченные радиоактивными атомами или флуоресцентной меткой (см. Липидные зонды), используют при проведении медицинских и биохим. исследований. В клетках С. гидролизуются при действии фермента сфингомиелиназы до церамида R H(0H) H(NH 0R ) H20H и фосфохолина. При наследственных дефектах в биосинтезе этого фермента [c.488]

Широкое распространение получают иммунофер-ментные методы - разновидность иммунных методов анализа (радиоактивная или флуоресцентная метка заменяется ферментом). Их используют для определения иммуноглобулинов, гормонов, стеровдов, лек. ср-в, пестицвдов и др. Эти методы обладают исключительно высокой чувствительностью и селективностью. [c.80]

Радиоиммунологический метод анализа (РИА) был предложен в конце 50-х годов. Возможность определять метку (изотоп 1) в очень малых концентрациях позволила достичь высокой чувствительности анализа (до пкг/мл) при высокой избтательности и экспрессности. За разработку этого метода его авторы Р. Йалоу и С. Берсон были удостоены Нобелевской премии в 1977 г. Недостатками этого метода являются ограниченный срок жизни радиоактивной метки относительно дорогое оборудование дпя регастрации радиоактивности возможность радиоактивного. заражения окружающей среды при проведении серийных анализов. В качестве альтернативы радиоактивным меткам было предложено использовать флуоресцентные метки и ферменты. [c.114]

В настоящее время 30% всех иммуноанализов в США включают применение изотопных меток. Остальные 70% выполняются в основном с помощью методов, в которых роль меток выполняют флуорофоры или ферменты. Применение нефелометрии ограничено анализом иммунных белков. Инфекционные заболевания в основном диагностируют с помощью гетерогенных методов с применением ферментных меток и бусин в качестве носителей, хотя 30% анализов выполняются с помощью более дешевых методик типа РИА. Контроль лекарственных препаратов осуществляют с помощью гомогенных методик, включающих применение ферментных меток или регистрацию поляризации флуоресценции. В случае анализа гормонов имеется большой выбор как гомогенных, так и гетерогенных методик с радиоактивными, ферментными и флуоресцентными метками. Доля неизотопных методов составляет 65% и имеет тенденцию к росту. Альтернативные методы йммуноана-лиза часто используются внутри определенной диагностической группы, например в анализах на тиреоидный статус. В США наиболее важным фактором является стоимость анализа, а различные технические аспекты обычно имеют второстепенное значение. В частности, 50% инструментального парка, используемого в иммуноанализе, работает с промышленно выпускаемыми реагентами. [c.19]

В опубликованных недавно книгах и обзорных статьях можно найти множество примеров ингибиторов, специфичных к активному центру [312, 313, 315]. Помимо химической модификации фермента и аффинного мечения за последние десять лет разработано еще несколько новых методов. Хотя эти методы и не имеют прямого отношения к бноорганнческому моделированию ферментов, о них все же следует упомянуть, так как в приложении к биологическим системам с их помощью можно получить полезную информацию, К ним относятся введение фотоаффинной метки [316] и использование флуоресцентной спектроскопической линейки [317]. Эти разработанные недавно методы включают в основном биофизические приемы, обсуждение которых выходит за рамки данной книги, но которые важны для лучшего понимания биологических процессов. Получаемая информация может быть ценным руководством к планированию и созданию новых биоорганических моделей биологически важных макромолекул. [c.450]

Для определения концентрации веществ в большинстве иммунохимических методов к анализируемому раствору, содержащему определяемое соединение и его меченый аналог, добавляют реагент в количестве, намного меньшем необходимого по уравнению (7.12). Как немеченые, так и меченые соединения взаимодействуют с реагентом практически одана-ково, поэтому отношение их концентраций будет одним и тем же в растворе и в связанном состоянии. При этом возможность применения метода во многом определяется доступностью меченого антигена и соответствующих антител. Для введения метки используют различные реагенты радионуклиды, ферменты, красящие вещества, флуоресцентные и хеми-люминесцентные зонды, ионы металлов. До последнего времени в качестве маркеров антител применяли радиоактивные изотопы этот метод назьшается радиоиммунохимическим анализом (РИА). При этом степень [c.298]

Ферментные метки. Каким образом ферменты могут выступать в качестве маркеров иммунохимических реакций, т. е. каким образом можно детектировать ферменты и в каких минимальных количествах Попадая в раствор, молекула фермента за одну секунду может превратить определенное количество субстрата в продукт. Допустим, что фермент за секунду может образовать тысячу молекул продукта, тогда за 17 мин это количество составит миллион. Если минимальное количество продукта, которое можно обнаружить фотометрическим методом, составляет 10 молекул/мл, то это означает, что для получения такого количества продукта необходимо 10 молекул/мл фермента, т. е. 10 моль/л. Чем выше чувствительность метода, тем меньшее количество фермента может быть обнаружено. Так, например, используя хемилюминесцентный или флуоресцентный метод детекции продукта, можно определять до 10 молекул фермента в 1 мл. Фотометрические или флуоресцентные методы могут быть использованы не во всех случаях например, если измерение проводят в очень мутной среде, применяются другие методы определения ферментативной активности электрохимические, микрокалориметрические и т. д. [c.108]

Для определения АГ использование АТ, конъюгированных с флуоресцентной или ферментной меткой, — часто в качестве второго антиглобулино-вого реагента — для окрашивания клеток и тканей. В случае применения фермента необходим нераство римый, окрашенный субстрат Для изучения и разделения клеточных популяций [c.29]

Ни пептид S-Tag, ни 103-звенный полипептид, используемый в качестве аффинного сорбента, не обладают ферментативной активностью, однако после образования комплекса в последнем индуцируется рибонуклеазная активность. Это позволяет количественно оценивать эффективность исследуемых систем экспрессии. Однако епде большей чувствительностью и удобством в применении обладают системы, в которых S-белок ковалентно связан с флуоресцентными красителями или ферментами (например, с классической пероксидазой хрена). Такую систему можно эффективно использовать для идентификации рекомбинантного белка с помопдью вестерн-блоттинга и ее часто применяют одновременно со второй аффинной меткой. [c.130]

Отсюда, при фиксированной концентрации антитела, равновесное отношение концентраций связанного и свободного антигена количественно связано с общей концентрацией лиганда. Это соотношение лежит в основе любого иммуноанализа. Таким образом, если ввести в анализируемую систему фиксированное количество меченого антигена, то можно определить и неизвестную концентрацию антигена. Неизвестную концентрацию антитела определяют при помощи меченых антител. Для введения метки в антитело или антиген можно использовать различные метящие агенты, такие, как радионуклиды, ферменты, красные кровяные клетки, флуоресцентные и хемилюминесцентные зонды или металлы. В радиоиммуноанализе (РИА) и иммуно-ферментном анализе (ИФА) метят антиген, а в иммунорадиометрическом (ИРМА) и иммуноферментометрическом (ИФМА) анализе - антитело. В большинстве методик иммунного анализа требуется порознь определять связанный и свободный меченый антиген или антитело. Поэтому эти методики довольно громоздки и длительны. [c.57]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология