Диагональный электрофорез

Весьма ценной разновидностью обычной тонкослойной или бумажной хроматографии является диагональная хроматография. Сначала нанесенный материал хроматографируют в одном направлении, затем в тонком слое на пластинке или бумаге проводят определенную химическую реакцию, после чего осуществляют разделение в другом направлении. Немодифицированные соединения располагаются по диагонали пластинки, тогда как продукты реакции оказываются смещенными по отношению к ней. Этим методом исследовали фотохимические [149] и другие [147] реакции флавинов. Аналогичный диагональный электрофорез применялся для идентификации пар —8Н-групп, образующих в белках дисульфидные мостики [150]. Пептидные фрагменты, содержащие 8—8-мостики, разделяли с помощью электрофореза на бумаге, затем обрабатывали бумагу парами надмуравьиной кислоты, разрывающей мостики [уравнение (2-20)], и после электрофореза в перпендикулярном направлении опрыскивали бумагу нингидрином. Пятна, расположенные вне диагонали, соответствовали фрагментам, которые участвовали в образовании 8—8-мостиков. По положению пятен подбирали [c.180]

Перенос материала с помощью пришивания, а также использование специфических химических реакций с некоторыми боковыми группами аминокислотных остатков позволили разработать особый метод электрофореза, так называемый диагональный электрофорез. С его помощью можно довольно легко выделять пептиды, имеющие в своем составе цистеин, цистин, метионин, гистидин или лизин. [c.96]

Б. МЕТОД ДИАГОНАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА [c.106]

Фиг. 22. Диагональный электрофорез пептидов, содержащих цистин.

А. Препаративный электрофорез при pH 6,5. Б. Электрофорез в перпендикулярном направлении фракций, содержащихся в полоске 2 после окисления. В. Определение локализации компонента X, сместившегося при электрофорезе в сторону от диагонали. Г. Препаративный диагональный электрофорез. [c.107]

Методика диагонального электрофореза аналогична процедуре, проиллюстрированной на фиг. 22. Неполный гидролизат, содержащий пептиды с метионином, подвергают электрофорезу. После окрашивания контрольной полоски вырезают аналитическую электрофореграмму, смачивают ее 0,1 М раствором иодацетамида в пири-дин-ацетатном буферном растворе с pH 3,5 [пиридин—уксусная кислота—вода (1 10 90)]. Смачивание производят осторожно распылителем или пипеткой. Необходимо, чтобы бумага пропиталась полностью, но не содержала избытка влаги. Влажную полоску на 14—16 ч помещают в эксикатор при комнатной температуре, На дно эксикатора наливают буферный раствор pH 3,5 для создания соответствующей атмосферы. Необходимо следить, чтобы в эксикаторе части бумажной полоски не соприкасались друг с другом. После инкубации электрофореграмму высушивают на воздухе и избыток иодацетамида удаляют отмыванием в ацетоне, 3—4 раза погружая в него полоску. Сухую полоску пришивают к новому листу фильтровальной бумаги и подвергают электрофорезу, используя тот же самый буферный раствор, который применялся при первом электрофорезе, но проводя разделение под прямым углом к первоначальному направлению. Пептиды, содержащие метионин, благодаря изменению суммарного заряда на -]-1 единицу сместятся в сторону катода от диагонали, по которой располагаются другие пептиды. [c.109]

Исследуемый белок гидролизуют трипсином и гидролизат подвергают электрофорезу на бумаге. Ориентируясь по контрольной полоске, вырезают полоску для аналитического диагонального электрофореза и осторожно опрыскивают ее карбоксипептидазой В, растворенной в 0,1%-ном бикарбонате аммония. Опрысканную полоску на 1 ч помещают в эксикатор, содержащий воду, при 37°С. После инкубации полоску высушивают и подвергают вновь электрофорезу под прямым углом к первоначальному направлению. [c.113]

Расщепление полипептидных цепей, содержащих дисульфидные мостики, обычно приводит к сложной смеси низших пептидов. При реконструкции полипептидной цепи установление исходного порядка дисульфидных связей — довольно трудная задача. Один из путей ее решения дает диагональный электрофорез по Хартли, при котором пептиды после ферментативного гидролиза сначала разделяют электрофоретически на полосе бумаги. [c.365]

Проведя аналитический диагональный электрофорез, определяют локализацию зоны компонента X на препаративной электрофореграмме и вырезают участок, содержащий искомую фракцию 3 (фиг. 22,В). Этот отрезок бумаги точно так же, как и аналитическую электрофореграмму, обрабатывают надмуравьиной кислотой, затем пришивают к новому листу бумаги и подвергают электрофорезу при pH 6,5 (фиг. 22,Г). На окрашенной контрольной полоске обычно можно обнаружить две зоны. Одна из них содержит компоненты, локализующиеся диагонально в данном случае они не представляют для нас интереса. Другая зона располагается ближе к аноду, чем первая. Именно в ней находятся пептиды, содержащие цистеиновую кислоту, причем чаще всего в достаточно гомогенном виде. [c.108]

При ферметативном гидролизе дисульфидная связь между двумя остатками цистеина, образующими дисульфидный мостик, может разорваться еще до воздействия надмуравьиной кислотой. Дисульфидный мостик может также связывать две разные цепи друг с другом. В этих случаях после разрушения дисульфидных связей при диагональном электрофорезе можно обнаружить два смещенных компонента. [c.108]

Пептиды, содержащие метионин, можно выделить методом диагонального электрофореза. В основе метода лежит специфическая реакция метионина с иодацетамидом в кислой среде в результате образуется карбамоилметилсульфониевая соль метионина (КМ-метионин). [c.109]

Установив с помощью аналитического диагонального электрофореза локализацию зоны пептидов с гистидином на препаративной электрофореграмме, ее вырезают и после обработки парами аммиака вновь подвергают электрофоретическому разделению в препаративном масштабе. [c.111]

Рис. 28. выделение цистинсодержащих пептидов методом диагонального электрофореза. [c.76]

Расщепить пептиды по остатку метионина можно с помон ью агентов, алкилирующих тиоэфирную группу по механизму реакции, аналогичному расщеплению бромоцианом. Наиболее эффективным реагентом оказался иодоацетамид [109, ПО]. При обработке апокаталазы этиленимином идет реакция присоединения по тиоэфирной группе метионина с образованием амино-этилсульфониевой соли с последующим расщеплением пептидной связи [166]. В сочетании с методом диагонального электрофореза эту реакцию применяли для идентификации и выделения пептидов, содержащих остатки метионина [187, 188]. [c.101]

Из всех использованных методов пептидного картирования наиболее элегантным является метод диагонального электрофореза (ЭФ), основанный на отсутствии свободной карбоксиль-ной группы в амидированных белках. Перед ферментативным расщеплением амидируют карбоксильные группы боковых цепей и С-концевой аминокислоты. После гидролиза С-концевой фрагмент оказывается единственным, не имеющим свободного карбоксила. Его можно селективно идентифицировать, так как его ионный заряд, а следовательно, и электрофоретическая подвижность почти одинаковы при изменении pH в любую сто рону от pH 3,5 (р/С а-карбоксильной группы). Подвижности пептидов, содержащих свободную карбоксильную группу, увеличатся при подкислении раствора (рН<3,5). После двумерного ЭФ на диагонали электрофореграммы обнаруживается только С-концевой пептид. [c.485]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология