Отжиг денатурированной ДНК

Белки, ренатурация (отжиг) — процесс, обратный денатурации, состоит в повторном хаотическом свертывании хаотичной белковой молекулы (денатурированной) в нативную конформацию. Материальной основой для рена рацни является специфическая аминокислотная последовательность в молекуле белка, так как нативная его конформация возникает в результате взаимодействия аминокислотных остатков между собой и с растворителем. Ренатурация возможна только при обратимой денатурации. Ренатурация — процесс самопроизвольный. [c.15]

Полная денатурация молекулы ДНК приводит к расхождению комплементарных цепей. При быстром охлаждении раствора денатурированной ДНК цепи остаются в разделенном состоянии. Однако, если в течение какого-то времени поддерживать температуру чуть ниже значения Тпл (этот процесс называют отжигом), может вновь восстановиться нативная структура. Этот факт дает в руки ученым очень важный метод [c.142]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК Основной недостаток олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза с использованием фага М13 -большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага М13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК. Это позволяет обойтись без переноса Интересующего исследователя гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагенеза - обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину в середине последнего заменен один нуклеотид (рис. 8.3). Клетки Е. соИ трансформируют вектором, несущим ДНК-мишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеоти- [c.161]

Наряду с описанным выше методом гибридизации применяют также так называемую конкурентную гибридизацию. В этом случае отжиг иммобилизированной ДНК на фильтре с реперной ДНК проводят в присутствии избытка фрагментированной и денатурированной гетерологичной ДНК. [c.113]

При этой концентрации снята кривая рис. 86, на которой скорость ренатурации (вернее, глубина ренатурации, достигаемая в течение 1 часа отжига) отложена как функция температуры отжига. Опыты в этом случае ставились так же, как в эксперименте, изображенном на рис. 83, т. е. ДНК нагревалась, быстро охлаждалась, причем денатурированное состояние фиксировалось, а затем она отжигалась при постоянной температуре в течение [c.269]

В первом цикле ЛЦР два синтезированных олигонуклеотида отжигаются с исследуемой денатурированной ДНК (как и при [c.241]

Оценка числа копий с помощью метода реассоциации в условиях насыщения. А. Отжиг разных количеств препарата Н-меченной цепи клонированного сегмента ДНК с одинаковым количеством фрагментированной денатурированной геномной ДНК (в растворе). Две верхние кривые отражают ситуацию, когда в реакционную смесь добавляли клонированный не радиоактивный сегмент в количестве, эквивалентном одной и двум копиям. Б. Фиксация препаратов денатурированной геномной ДНК в виде пятен на нитроцеллюлозном фильтре (рис. 7.39). После инкубации препаратов с Р-меченной ДНК фильтр промывали и либо получали радиоавтограф (как в данном случае), либо вырезали пятна и подсчитывали число импульсов в каждом из них. [c.342]

Получить большие коллекции клонированных колоний или бляшек на нитроцеллюлозных фильтрах не составляет труда. Бактерии и дрожжи хорошо растут на самом нитроцеллюлозном фильтре, помешенном на соответствуюший питательный агар (рис. 6.21). Фильтр, содержаший колонии, обрабатывают так, чтобы произошли лизис клеток и денатурация ДНК, отжигают денатурированную ДНК с зондом, идентифицируют бляшки, ДНК которых гибридизовалась, и отбирают клетки из соответствуюшего участка агара. Фаговые бляшки переносят на нитроцеллюлозный фильтр, наложив его на питательный агар (рис. 6.22). За один раз на фильтр может быть перенесено до 10000 бляшек с одной чашки диаметром 10 см. Если осторожно снять фильтр, то ДНК из каждой бляшки останется фиксированной на нем. После отжига и идентификации нужных бляшек можно отобрать фаговые частицы из бляшек, оставшихся на чашке с агаром. [c.293]

Различие в прочности сорбции на оксиапатите нативной (дву-нитевой) и денатурированной (однонитевой) ДНК широко используется для исследования структурного состава ДНК по скорости ее ренатурации в ходе отжига , для выявления однонитевых участков, для отделения гибридных молекул (ДНК—РНК) от однонитевых партнеров и др. [c.241]

Рис. 4.12. Получение меченого ДНК-зонда методом случайных праймеров. К денатурированной двухцепочечной ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, которую предполагается использовать в качестве зонда, добавляют гексануклеотиды (смесь всех возможных комбинаций из шести нуклеотидов) и отжигают смесь. Некоторые из олигонуклеотидов гибридизуются с немеченой денатурированной ДНК, и в присутствии фрагмента Кленова и четырех с1НТР (один из которых меченый [ ]) служат затравкой для синтеза комплементарной цепи. После денатурации синтезированной ДНК получают смесь меченых фрагментов ДНК, которые вместе составляют практически полноразмерную исходную ДНК-матрицу.

Рис. 3. Кривые ренатурации ДНК мыши и ДНК из Е. соИ Фрагменты денатурированной ДНК размером 400 п н. отжигали при разных величинах Со/ и определяли количество ренатурированной ДНК с помощью хроматографии на гидроксилапатите. ДНК Е. oli денатурирует в узком интервале oi, будучи представлена только уникальными последовательностями, ДНК мыши распадается на несколько кинетических компонентов (по результатам, полученным Дж. Хирстом).

При нлавлении спиралей ДНК и закалке денатурированной структуры быстрым охлаждением происходит уничтожение трансформирующей активности. При отжиге и ренатурации ДНК трансформирующая активность восстанавливается (см. рис. 83). При оптимальном режиме охлаждения или отнчига удается восстановить до 50% первоначальной трансформирующей активности ДНК. Мы уже рассматривали в главе П1 доказательства того, [c.348]

Циклические перестановки — структурные огобенности поведения некоторых фаговых ДНК, подвергнутых температурной денатурации и последующему медленному отжигу. Напрнмер, денатурированная линейная двухцепочечная ДНК бактериофага Т2 при медленном отжиге образует кольцевые молекулы, что происходит вследствие того, что популяция молекул фаговой ДНК состоит из набора молекул с циклическими перестановками. Схематически такие структурные перестройки показаны на рис. 34. [c.87]

Однако вопреки этим данным результаты изучения состава оснований и способности к гибридизации указывают на существование явного различия между данными типами Д]ЗК. Это и неудивительно, так как способность к гибридизации зависит от существования в цепях ДНК более длинных участков с одинаковой последовательностью, чем те, которые можно выявить методом ближайших соседей. По существу метод гибридизации заключается в том, что два типа денатурированной нагреванием ДНК (или РНК) смешивают и смесь очень медленно охлаждают (отжиг). Если одна из этих кислот содержит радиоактивную метку, то ее включение в гибридную двойную спираль можно измерить. О происшедшей гибридизации судят по образованию двухцепочечных ДНК, которые нетрудно отдифференцировать от двухцепочечных ДНК с помощью обычных методов ультрацентрифугироваиия. О двухцепочечном строении ДНК говорит и устойчивость к действию нуклеаз [561, 562]. [c.119]

Степень ренатурации, которая наблюдается на опыте, зависит от экспериментальных условий и от природы ДНК. Если резко понизить температуру раствора от значения, лежащего значительно выше 7" , до значения, лежащего намного ниже вероятность того, что разошедшиеся комплементарные цепи найдут друг друга, будет очень мала. Внут-рицепочечная вторичная структура, сформировавшаяся при охлаждении, будет очень стабильна, и восстановление нативной структуры окажется полностью блокированным. Такую ДНК обычно называют денатурированной, хотя считать ее одноцепочечной, как это часто делают, нельзя. В ней имеются двухцепочечные области, которые препятствуют ренатурации. Если вместо быстрого охлаждения производить медленный отжиг ДНК, постепенно понижая температуру раствора или в течение длительного времени поддерживая ее на одном уровне вблизи Т , то, хотя внутрицепочечные шпильки и будут образовываться, они будут не очень стабильны. Со временем сформируются правильные зародыши двухцепочечной формы, и по мере дальнейшего понижения температуры будет происходить их разрастание вплоть до образования нативной структуры. [c.343]

Денатурация ДНК — процесс обратимый. Если ДНК только частично денатурирована, например при нагревании, то при снижении температуры происходит быстрая ренатурация каждой молекулы ДНК, скорость которой соответствует реакции первого порядка. Если ДНК полностью денатурирована, две комплементарные нити будут реассоциировать медленно ( отжиг ДНК). Этот процесс включает две стадии сначала по реакции второго порядка происходит сборка комплементарных последовательностей двух нитей, а затем по реакции первого порядка — быстрое их защелкивание . Если начальная концентрация денатурированной ДНК Со (молярная концентрация фосфата ДНК), то изменение концентрации С одноцепочечной ДНК во времени подчиняется уравнению реакции второго порядка с1с/(И—К2С , интегральная форма кото- [c.226]

Если раствор ДНК, денатурированной нагреванием, охлаждать, то вновь возникают слабые связи, и при определенных условиях могут получиться двуспиральные структуры, идентичные структурам исходного (до денатурации) препарата т. е. произойдет ренативация (отжиг ДНК). На явлениях денатурации и ренативации основс1н метод молекулярной гибридизации, который применяют для изучения строения нуклеиновых кислот, а также для их фракционирования. [c.112]

Оценка количества специфичной РНК в смеси молекул РНК с помощью дот-блоттинга . Два препарата РНК (а и б) в трех вариантах каждый (количества 5,0 2,5 и 1,3 мкг) фиксировали на нитроцеллюлозном фильтре и затем отжигали с избытком Р-зонда, представляющего собой одноцепочечную ДНК (клонированную в векторе М13). Количество зонда, гибридизовавшегося в каждом из этих случаев, определяли с помощью радиоавтографии. Количество РНК в препарате, комплементарной зонду, оценивали путем сравнения плотности пятен, опытных и контрольных, полученных при нанесении известных количеств клонированного сегмента ДНК. Стандарты готовили из дуплексной денатурированной ДНК. (С любезного разрешения и. 8ко А/-гопзкк) [c.350]

Установление структурного родства между клонированным сегментом ДНК и гомологичной клеточной РНК с помощью специфичной к одноцепочечной ДНК нуклеазы 81. В приведенном примере смесь цитоплазматических молекул ро1у(А )-РНК отжигали с денатурированным препаратом радиоактивно меченной клонированной ДНК в условиях, благоприятствующих образованию дуплексов РНК-ДНК. С помощью нуклеазы 81 удаляли ту часть ДНК, которая не образует гетеродуп- [c.352]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология