Оксиапатит

Резюмируя, можно сказать, что хроматографическое фракционирование и очистка белков на оксиапатите остаются пока методами эмпирическими, где предсказать результаты и дать заранее определенные рекомендации ио выбору оптимальных условий элюции затруднительно. [c.228]

НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ ХРОМАТОГРАФИИ НА ОКСИАПАТИТЕ [c.231]

Располагая колонкой с термостатируемой рубашкой и опираясь на различие прочности сорбции нативной и денатурированной ДНК на оксиапатите, можно фракционировать фрагментированную ДНК по склонности к денатурации, например по ГЦ-составу. Для этого пропускают через колонку фосфатный буфер в концентрации, способной вымывать денатурированную ДНК, заведомо не снимая нативную (напрпмер, 0,08 М), и ступенями повышают температуру [c.236]

Очистку на оксиапатите в сходных условиях использовали и для выделения внехромосомной (вирусной) ДНК из клеток высших [c.239]

Полисахариды, в частности гликоген, слабо сорбируются на оксиапатите. Этим можно воспользоваться для существенной очистки НК в ходе их выделения от сопутствующего им гликогена (нередко встречающееся использование для этой цели амилазы рекомендовать нельзя — в ней всегда могут оказаться примеси нуклеаз). [c.244]

Ион калия К — основной внутриклеточный ион, в то время как ион натрия Na+ — главный внеклеточный ион их взаимодействие поддерживает жизненно важные процессы в клетках. В организме человека растворимые ооли натрия хлорид, фосфат, гидрокарбонат — входят в состав плазмы крови, лимфы. Ионы магния и кал1)Ция образуют комплексы с нуклеотидами (например, А"Ф), связываясь с фосфатными группами, тем самым участвуют в терморегуляции организма. Кальций —основной элемент для образования и поддержания т.зких структур, как зубы, кости минерал оксиапатит ЗСаз (РО4) 2 Са (ОН) 2 — основа костной ткани. [c.292]

Нуклеотиды 661 Нуклоны 60 Облако электронное 64 Область перекрывания 1лектрон ных облаков 95 Оболочка электронная 54 Общая электронная пара 94 Объем молярный газа 24 Озон 9, 355 Окисление 118 Окислитель(и) 118 с л Оксиапатит 292 Оксигруппа, см, гидрокгил Оксидная пленка 279 Оксиды 29, 32 сл., 226 сл [c.706]

Некоторое недоумение на первый взгляд может вызвать другая работа, где гидрофобная обратнофазовая хроматография использовалась, как и выше, для фракционирования негистоновых белков хроматина. В этой работе предварительно отделенные от нуклеиновых кислот и гистонов (на оксиапатите) белки хроматина сначала диали-зовали против довольно концентрированного раствора сульфата ам- [c.182]

Мы привели довольно длинный список широко известных ад- opGeirroB, которые не используются в интересующих нас хроматографических методах очистки и фракционпрования биополимеров, для того чтобы освободить подход к практически единственному варианту адсорбционной хроматографии, который широко и плодотворно применяется для этой цели. Речь идет о хроматографии белков и НК на оксиапатите. [c.224]

Хроматографию на оксиапатите чаще используют не для фракционирования, а для очистки одного из компонентов смеси, заведомо отличающегося ио прочности сорбции от остальных. В этом случае тем более нет смысла удлинять колонку. Любопытно отметить, что необходимая молярность элюирующего фосфатного буфера снижается при увеличении загрузки колонки. По-видимому, конкурируя за точки сорбции, молекулы белков мешают друг другу, не давая занять положение максимально прочной многоточечной сорбции. [c.227]

Все сказанное выше еще в значительной стеиени относится к области предположений, многое в механизме сорбции кислых белков на оксиапатите остается неясным. Механизм этот явно сложнее, чем было здесь оиисано. В частности, можно не сомневаться, что, кроме [c.227]

I Механизм сорбции нуклеиновых кислот и их производных на оксиапатите, ио-видимому, во многом аналогичен механизму сорбции кислых белков. Вместо карбоксилов во взаимодействии с ионами кальция на поверхности сорбента участвуют остатки фосфатов полинуклеотидной цепи. Для моно- и олигонуклеотидов наблюдается явная зависимость силы сорбции от длины цеии (из-за многоточечной сорбции Мононуклеотиды в присутствии 1 мМ фосфатного буфера задерживаются на сорбенте слабо, а основания и нуклеозиды не задерживаются вовсе. Ди- и тринуклеотиды сорбируются гораздо прочнее решающую роль играют здесь фосфаты. Любопытно, что сказывается не только их число, но и расположение) Наиример, нуклеозидтрифосфаты сорбируются заметно прочне ё чем тринуклеотиды. Небольшие олигонуклеотиды хорошо сорбируются в 1 мМ фосфатном буфере, но относительно легко элюируются (0,02—0,0.3 М фосфатным буфером). орбция самих нуклеиновых кислот гораздо более прочна ]Я1 Элюцию осуществляет фосфатны буфер с концентрацией 0,12—0,25 М Размер высокомолекулярной нуклеиновой кислоты сказывается мало. По-видимому, достаточно отдаленные участки длинной цепи полинуклеотида благодаря их гибкости элюируются одновременно и независимо друг от друга. [c.229]

Самой замечательной особенностью сорбции нуклеиновых кис-ло1 а оксиапатите является резко различное поведение нативных двунитевых молекул ДНК (или РНК) и однонитевых молекул денатурированных ДНК и РНК. Однонитевые молекулы снимаются с оксиапатита элюцией 0,12—0,15 М фосфатным буфером, тогда как для элюции двунитевых молекул концентрацию фосфатного буфера приходится увеличивать до 0,2—0,25 Ш Можно предположить, что решающую роль здесь играет относительная жесткость линейной конформации двунитевых молекул. Сопоставим мысленно условия десорбции относительно коротких фрагментов нативной и денатурированной ДНК, связанных ио длине фрагмента с оксианатитом, наиример в трех точках. Вытеснение элюентом пз связи с оксиапа-титом гибкой однонитевой ДНК в одной из таких точек может повлечь за собой (в результате тепловых деформаций гибкой нити) удаление прежде участвовавшего в этой связи фосфата ДНК от фиксированного на поверхности сорбента иона кальция. Затем может последовать поочередный разрыв и двух других связей — фраг- [c.229]

Примеры использования оксиапатита для разделения одно- и двунитевых молекул нуклеиновых кислот и соответствующие практические рекомендации будут приведены в следующих разделах. Общее рассмотрение сорбции НК на оксиапатите закончим указанием на то, что на 1 мл уиакованного оксиапатита можно сорбировать 0,2—0,5 мг ДНК, однако для целей фракционирования ие следует превышать первой из этих цифр. Присутствие ЭДТА и цитрата препятствует сорбции, по-видимому, за счет блокирования кальция на поверхности сорбента. Следует упомянуть о том, что в аналитических опытах при избытке сорбента не только элюцию, но и исходную сорбцию НК на оксиапатите следует производить достаточно медленно, например в течение 30 мин, с тем чтобы дать возможность молекулам ДНК или РНК отыскать наиболее благоприятное для сорбции расположение на поверхности сорбента. [c.230]

Еще в 1966 г. Бернарди и соавторы [Bernardi et al., 1966] продемонстрировали возможность использования хроматографии на оксиапатите для очистки ферментов иа примере разделения различных нуклеаз селезенки (рис. 102). Элюцию вели линейным градиентом концентрации фосфатного буфера (0,05—0,5 М), pH 6,8. [c.233]

Для очистки мембранной D-лактатдегидрогеназы Е. соИ хроматографией на оксиапатите [Pratt et al., 1979] был использован пологий линейный градиент концентрации (0—0,2 М) К-фосфатного буфера, pH 7,2 (500 мл для колонки размером 2,6 X 20 см). Растворимость белка обеспечивали включением в состав буфера детергентов (1% Тритона Х-100 и 0,1% ДДС-Na). Очистке на оксиапатите предшествовали освобождение фермента из ме.мбрин с помощью дезоксихолата натрия, хроматография на DE-52 и гель-фильтрация на сефадексе G-200. На всех хроматографических этапах очистки в составе элюентов тоже присутствовали детергенты. [c.234]

В одной из недавних работ [ aiafa et al., 1981) белки хроматина после частичного гидролиза микрококковой нуклеазой сорбировали на оксиапатите (в объеме) в 0,001 М К-фосфатном буфере (pH 7,2), [c.235]

Фокс и соавторы исследовали зависимость прочности сорбции на оксиапатите нативной и денатурированной ДНК от температуры сорбента и концентрации элюирующего фосфатного буфера. В случае фрагл1ентированной ДНК из плаценты длиной около 500 пар основании авторы регистрировали различие в прочности сорбции правельных двунитевых структур с температурой плавления 84° и несовершенных структур с неточным спариванием нитей, температура плавления которых составляла соответственно 77° и 70°. На рис. 106 результаты этого исследования представлены в виде диаграммы. Под нижней кривой лежит область связывания с оксиапа-титом как нативной, так и денатурированной ДНК. Выше верхней кривой располагается область элюции нативной ДНК. Между кривыми заключена область значений концентраций фосфатного буфера и температур, в которой на оксиапатите удерживается нативная ДНК, а денатурированная элюируется. Пунктиром я точками обозначены верхние границы атой области для случаев несовершенного спаривания нитей ДНК. Показанные на диаграмме границы областей не являются линиями истинно фазовых переходов на самом деле эти границы имеют диффузный характер. Здесь они обозначают соотношение параметров, при котором за определенное время элюируется 50% ДНК соответствующего типа. Положение границ зависит от нуклеотидного состава ДНК, последовательности нуклеотидов и партии оксиапатита — их следует рассматривать как ориентировочные. Тем не менее небезынтересно отметить различие ха- [c.237]

Наличие некоторых примесей или специально добавленных реагентов может существенным образом изменять характер элюции НК с оксиапатита. Например, присутствие ионов ртути и особенно серебра в комплексе с ДНК существенно затрудняет элюцию однонитевой ДНК. Эти ионы нередко используют при фракционировании ДНК ультрацентрифугированием в градиенте концентрации sjSO [Остерман, 1981]. Если такая операция предшествовала очистке ДНК на оксиапатите, то следует принять специальные меры для удаления этих ионов [Markova et al., 1978]. [c.238]

Очистку плазмидной ДНК от примеси РНК (после осаждения ДНК бактерии-хозяина из просветленного лизата ) можно осуществлять в препаративном варианте на колонке оксиапатита и без участия бромистого этидия, но в присутствии 8 М мочевины, что обеспечивает сохранение однонитевой структуры РНК. Окси-апатит (1 г на 1 л лизата бактерий) суспендировали в 0,2 М Na-фосфатном буфере (pH 6,8) с добавлением до 8 М мочевины и заполняли им широкую колонку. Освобожденный от ДНК хозяина лизат без какой-либо дополнительной очистки разбавляли в соотношении 9 1 0,27 М Na-фосфатным буфером (pH 6,8) с 9 М мочевиной и 0,9% ДДС-Na и вносили в колонку. Ее промывали сначала тем же раствором, но без ДДС-Na, потом 0,01 М Na-фосфатным буфером без мочевины (при этой промывке сорбент один раз взмучивали и снова давали ему осесть). Все белки и РНК выходили из колонки в ходе промывок. Плазмидную ДНК элюировали 0,3 М Na-фосфатным буфером. По данным авторов, ее выход сильно варьировал от одной партии оксиапатита к другой. Из больших объемов бактериальных лизатов все нуклеиновые кислоты целесообразно сначала осадить этанолом. Показано, что разрывы в плазмидной ДНК в ходе очистки на оксиапатите не появляются [ olman et al., [c.239]

Джонсон и Илан недавно отметили, что методика Колман и соавторов дает не всегда воспроизводимые результаты и загрязнения плазмидной ДНК белком и РНК в некоторых случаях оказываются значительными. Они ввели в эту методику промывку колонки с сорбированной на ней ДНК 0,35 М Na-фосфатным буфером (вместо 0,27 М) в присутствии 6 М мочевины. Такая промывка надежно удаляет РНК и белок. Они также показали возможность очистки на оксиапатите высокомолекулярной ДНК фага X. Оказалось, что в присутствии 8 М мочевины эта ДНК сорбируется на нем обратимо [Johnson, Пап, 1983]. [c.239]

Приведенные примеры иллюстрируют возможность использования оксиапатита для очистки более или меиее высокополимерной ДНК. На колонках с этим сорбентом удается фракционировать и короткие фрагменты ДНК по их длине. Для фрагментов денатурированной ДНК длиной от 4 до 180 нуклеотидов такое фракционирование было недавно описано [Wittelsberger, Hansen, 1979]. Авторы использовали посадку смеси фрагментов на оксиапатит в воде и элюцию линейным градиентом концентрации фосфатного буфера (0—0,1 М — для очень коротких фрагментов, 0—0,35 М — для более длинных). [c.240]

Оксо-анионы, содержащие фосфор. Среди большого числа ок-со-анионов пятивалентного фосфора P(V) самыми важными являются анионы трехосновной ортофосфорной кислоты Н3РО4 или 0=Р(0Н)з. Ортофосфаты содержат тетраэдрические группы РО4, Известны фосфаты POf , НРО " и Н2РО4 большинства металлов. Некоторые из них имеют большое практическое значение, например фосфат аммония как удобрение буферные растворы из фосфатов щелочных металлов применяют в химическом анализе и т. д. Все природные фосфорные минералы являются ортофосфатами. Главный из них — фторапатит Са РО )б Са 2. Оксиапати-ты, содержащие карбонат кальция, входят в состав минеральной части зубов. [c.138]

Различие в прочности сорбции на оксиапатите нативной (дву-нитевой) и денатурированной (однонитевой) ДНК широко используется для исследования структурного состава ДНК по скорости ее ренатурации в ходе отжига , для выявления однонитевых участков, для отделения гибридных молекул (ДНК—РНК) от однонитевых партнеров и др. [c.241]

Исследование ренатурации ДНК с помощью сорбции на оксиапатите можно вести и в объеме. Например, аликвоты ДНК, рена-турирующей при температуре отжига, переводили в 0,156 М К-фосфатный буфер и смешивали с суспендированной в том же буфере кашицей оксиапатита, затем перемешивали в течение 15 мин и центрифугировали в настольной центрифуге. Выход однонитевой ДНК определяли в супернатанте, а всю остальную ДНК считали ренатурировавшей и сорбированной на оксиапатите. Для подавления неспецифической сорбции добавляли немеченную тимусную ДНК [Paetkau, Langman, 1975]. [c.242]

Можно было бы процитировать множество вариантов метода очпстки гибридных молекул от однонитевых исходных партнеров на колонках оксиапатита, однако с хроматографической точки аренпя они не представляют болыпого интереса. По существу, это всегда не истинно хроматографическое фракционирование, а простейший процесс разделения двух компонентов (однонитевых и двунитевых молекул НК), весьма существенно различающихся по прочности их сорбции на оксиапатите. [c.244]

Дихлордифе-нилсульфон (I), HjO Бутанол-2 я-Хлорфенил-я-гидроксифенилсуль-фон, НС1 Реакции Разложение с Бутен-1 (I), транс-бутен-(И), цас-бу-тен-2 (III), HuO Фосфат кальция с добавкой небольшого количества фосфата меди паровая фаза, в феноле, 350—450° С, I НзО= 1 20 —30 (мол.) [142] разложения omuifinABHueM. воды aS04 (выдержанный И ч при 150° С) в продуктах при 270° С — I — 23,5%, II — 21,5%, 111—55%, при 420° С — I — 33,5%, 11 — 26,6%, III — 40% [143] Оксиапатит (Са Р = 1,58 1,67) микрокаталитический импульсный метод, 276—370° С [144] [c.98]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология